熒光定量PCR

　　熒光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。

　　原理

　　PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；剛開始時, 探針結合在DNA任意一條單鏈上；PCR擴增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。或者使用熒光染料SYBR。SYBR可以結合到雙鏈DNA上面，當體系中的模板被擴增時，SYBR可以有效結合到新合成的雙鏈上面，隨著PCR的進行，結合的SYBR染料越來越多，被儀器檢測到的熒光信號越來越強，從而達到定量的目的。

　　應用領域

　　臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感、結核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優生優育檢測；腫瘤標志物及瘤基因檢測實現腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現遺傳病診斷。

　　動物疾病檢測：禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。

　　食品安全：食源微生物、食品過敏源、轉基因、乳品企業阪崎腸桿菌等檢測。

　　科學研究：醫學、農牧、生物相關分子生物學定量研究。

　　應用行業：各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業及乳品廠等。

　　熒光定量PCR前景展望

　　實時熒光定量PCR的出現，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現了絕對定量。多種檢測系統的出現，使實驗的選擇性更強。自動化操作提高了工作效率，反應快速、重復性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰。隨著生物芯片技術和熒光探針定量技術的結合，熒光定量PCR在醫學檢測及其他各個領域中的應用前景將更加廣闊，令人欣喜。盡管如此我們也應清晰認識到，FQ-PCR技術在我國各個研究領域的應用并不多見，這就需要我國學者迎頭趕上，使FQ-PCR技術更充分地推廣，以推動研究工作的快速發展。

　　熒光定量PCR操作步驟

　　熒光定量PCR

　　實驗步驟：

　　熒光定量PCR樣品RNA的抽提

　　①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

　　②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

　　③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。

　　④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。

　　⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

　　⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

　　熒光定量PCRRNA質量檢測

　　1）紫外吸收法測定

　　先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。

　　① 濃度測定

　　A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 μg/ml。具體計算如下：

　　RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260 = 0.21

　　RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

　　取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：

　　35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

　　②純度檢測

　　RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

　　2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定

　　①制膠

　　1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

　　10×MOPS電泳緩沖液

　　濃度 成分

　　0.4M MOPS，pH 7.0

　　0.1M 乙酸鈉

　　0.01M EDTA

　　灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

　　②準備RNA樣品

　　取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

　　③電泳

　　上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。

　　④紫外透射光下觀察并拍照

　　28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。