教你快速了解制備型液相色譜

1）低壓液相色譜；（2）中壓液相色譜；（3）高壓液相色譜；（4）快速色譜。低壓、中壓與高壓液相色譜的壓力范圍之間會存在一定交疊，沒有統一、明確的標準。

　　1.快速色譜

　　柱壓通常為2bar（或30psi）左右，對于那些容易分離的簡單混合物，由于快速色譜具有操作簡便、經濟等優點，常常是實驗室的。但快速色譜不同于一般的層析分離，這種分離沒有壓力，而快速分離通常使用瓶裝氮氣加壓，使流動相具有一定的流速，從而縮短了分離時間。

　　快速色譜使用的柱子一般是玻璃柱，柱直徑為3～10cm．長度為7～15cm。快速色譜中使用zui廣泛的固定相為硅膠。采用的粒徑通常為：25～40μm，40～63μm或63～200μm的球形固定相。其它如鍵合相、氧化鋁、聚酰胺吸附劑也常用作快速色譜的固定相使用。

　　2.低壓色譜（LPLC）

　　柱壓一般低于5bar（或75psi）。

　　低壓色譜一般是由蠕動泵、進樣閥和檢測器組成，可以連續化，實現自動的梯度淋洗和餾分收集等操作。色譜柱管一般是玻璃或聚合物材料的，長度一般為240-440mm，內徑為10-40mm。

　　對于大多數在紫外區有吸收的物質，光學檢測器很常用。填料一般使用軟質的葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、合成高聚物或離子交換劑，粒徑一般為40-60μm。

　　3.中壓液相色譜（MPLC）

　　柱壓在5-20bar（或75-300psi）之間，廣泛用于實驗室和工業規模的生物制品(如動物臟器提取液、濃縮液、體液、植物提取液、生物技術發酵液等--往往需要經過濾膜作初級凈化)的處理，以提取或純化所需的產品。

　　中壓液相制備色譜的主要部件為輸液泵、進樣閥、檢測器、餾分收集器等，早期的中壓液相制備色譜，其輸液泵zui大流速可達156mL/min，并配有阻尼器，以保證液流的穩定；進樣器配有0.5-50mL的不同體積的定量管；檢測器有紫外和示差折光檢測器，流通池體積比較大，允許大流量流動相通過而無需分流；餾分收集器有原盤式和排式兩種，原盤式的接收管zui多達80個，而后者則更多；色譜柱內徑9-105mm，長度250-1760mm不等。

　　對于一般中壓制備色譜，當色譜柱直徑較大時，柱頭往往設計成錐形或有類似于傘狀的液流導向結構，使得當大量樣品進入到柱頭上時，能迅速地分散到整個柱橫截面上，及時被流動相沖走，避免了因樣品的局部過濃而引起柱超負荷和譜帶加寬。柱子填料則采用比較耐壓的交聯改性的多糖凝膠(如Sepharose CL，Superose等)，聚合物微球，復合材料介質或硬質SiO2基體的化學鍵合相等，粒徑一般在25～40μm（zui常用的填料尺寸是15-25μm，25-40μm或40-63μm），可采用濕法或干法裝柱。

　　4.高壓液相色譜(HPLC)

　　是指柱壓一般大于20bar（或300psi）的“高壓(或)液相色譜”，通常指所用色譜柱的塔板數大于2000，一般是在2，000～20，000的范圍之間。

　　當需要從大量的物質中分離純化不足1％的所需成分時，分離工作將會十分困難，往往在純化的zui后階段需要使用10μm或更小顆粒的填料。為獲得所需微量組分，可采用如下分離手段：制備型分離→半制備型分離→分析型分離→產物。為提高每次分離獲得純品的數量，制備型高壓液相色譜分離通常在超載情況下運行。

　　高壓液相色譜，即目前常用的液相色譜。色譜柱內填裝的是粒度范圍較窄的微小顆粒固定相(3～30μm)，為使流動相流出，需采用較高的壓力，同時系統的復雜性及成本亦增大，但分辨率可得到較大的提高。而填裝較大顆粒的固定相時，如中壓液相色譜系統，裝柱較容易，柱的通透性較高(只需較低的泵壓力)，可采用更大的色譜柱和更經濟的儀器，由此分辨率也較低。

　　5

　　用分析型高壓液相色譜進行制備型分離

　　當所需純化合物的量很少時(微克級至幾毫克)，可用分析型色譜柱進行多次分離。效果和利用大直徑色譜柱進行一次性分離相同。采用小直徑色譜柱時，可利用已有的分析型儀器，而無需在色譜柱、填料及附件方面投入更大資金；另外，還可在很大程度上避免由于放大所產生的問題，使分離速度加快。

　　小直徑色譜柱的尺寸一般為250×4.6mm，通常裝有反相填料，每次可進樣5～100ug，通過多次進樣分離，可獲得足夠的純品。例如，Suzuki等(1994)報道從豆科植物羽扇豆(Lupinus Hirsutus)中分離一羽扇豆生物堿糖苷時，其zui后的分離步驟采用LiChrosorb Si60，5μm，250×4.6mm色譜柱進行高壓液相色譜分離，洗脫劑為含25％甲醇的yi醚溶液－5％氨水50:1。

　　經常需用分析型色譜柱進行分離的一個領域是對肽類化合物的純化。生物活性肽的含量通常很低，用分析型高壓液相色譜作為zui后的純化手段時，不會使色譜柱超載。

　　為了提高分離效率，可將分析型高壓液相色譜柱連接起來使用。此時可采用顆粒度在20～30μm的填料，以保持適當的通透性，尤其是當使用含水溶劑時。當使用己烷等有機溶劑時，由于流動相的粘度較低，可使用顆粒度為10μm的填料。

　　然而由于分析型色譜系統無法提供大規模制備型分離所需的流速，其應用受到一定限制。