毛細管電色譜儀分析技術

效毛細管電色譜儀（CEC）整合了液相色譜（HPLC）和毛細管電泳（CE）的優點，在毛細管柱中填充固定相顆粒、管壁鍵合或涂覆固定相、制成連續床固定相，以壓力和電滲流共同驅動流動相，利用樣品各組分在固定相和流動相中分配系數差異和本身淌度差異進行分離。在HPLC和CE雙重分離機理的作用下，CEC對樣品細微之處的分辨能力得到極大提高，既能分離帶電組分，又能分析中性分子，對復雜的混合樣品顯示出強大的分離潛力，代表微分離分析的趨勢。
    一、發展歷史：
    1974年，CEC出現，將電場施加到填充毛細管柱上，分離了數種溶質，顯示出以電滲流作為驅動力的優越性。但當時并沒有引起足夠的關注。
    1981年，將10μm ODS填料填入170μm內徑的毛細管柱中，在電場作用下成功分離了數種多環芳烴，獲得了31000TP/m的柱效，*次展示了CEC的巨大潛力。
    二、工作原理：
    CEC采用HPLC固定相，通過高壓輸液泵產生的液壓和在毛細管柱兩端加上高壓直流電場所產生的電場力，即依靠液壓和電滲流共同驅動流動相，使樣品組分根據它們的色譜行為和電泳速度的不同而達到分離。CEC具有HPLC和CE雙重分離機理，如同HPLC基于組分在固定相和流動相中的分配過程，如同CE基于組分的電遷移過程，使分離選擇性得到極大提高。電滲流的塞形流型改善了組分在毛細管柱中的流型和峰展寬，可獲得遠高于HPLC的柱效，對復雜樣品的分離能力遠遠超過單獨使用HPLC和CE。
    三、輸液系統：
    1、驅動流動相的動力：
    以高壓輸液泵和電滲流泵共同驅動流動相，流動相在液壓和電滲流的共同作用下通過毛細管柱，可穩定輸送幾百納升的流量。液壓和電壓可同時或獨立地施加在毛細管柱兩端，具有以下明顯的優勢：
    （1）可有效抑制分離體系中氣泡的產生。
    （2）采用壓力流和閥進樣，可方便地實現二元溶劑梯度洗脫，提高分析的靈活性、選擇性和分離速度。
    （3）從進樣到分離的整個過程中，高壓直流電場不間斷，保證了系統的穩定性和分析的重現性。
    2、微流控制系統：
    微流控制系統由分流閥、反壓閥、溶劑混合閥、定量進樣閥和限流閥等組成。
    （1）分流閥和反壓閥：
    維持恒定的毛細管柱前壓是色譜體系穩定的關鍵，可通過分流閥和反壓閥來實現。溶劑由高壓輸液泵以恒流形式泵出，在分流閥處轉為恒壓形式驅動，從而與高壓直流電場的電滲流相匹配，實現由樣品壓力和電場對柱內溶劑的同時驅動。
    （2）溶劑混合閥：
    50μL溶劑混合閥可實現二元溶劑的梯度混合，在保證混合效率的同時，抑制了梯度延時，保證了分析的準確性和重現性。
    （3）定量進樣閥：
    定量進樣閥為納升級定容進樣，保證了進樣的準確性和重復性。壓力流和進樣閥的存在，使系統可與樣品處理相連，實現實時在線樣品分析。
    該閥采用內置定量環，通過刻蝕實現納升級定量環的加工。定量環的出口通道為100μm，可通過PEEK接頭與100μm內徑的毛細管柱相連，極大地抑制了死體積的影響。
    （4）限流閥：
    限流閥的作用是在毛細管柱的出口端保持一定壓力，可抑制由于壓力驟然變化引起的氣泡，保證系統的穩定性。
    （5）微流控制系統的連接管路：
    微流控制系統的連接管路的內徑與定量進樣閥接口處的孔徑相同，從zui大程度上減小了進樣死體積和柱外體積的影響。
    四、高壓直流電源：
    1、0～30kV穩定、連續可調的直流電源。
    2、具有恒壓、恒流和恒功率輸出。
    3、具有電場強度程序控制功能。
    4、電壓穩定性在±0.1%。
    5、電源極性易轉換。
    五、固定相：
    固定相是影響電色譜柱柱效、分離選擇性和分離速度的重要因素，是發展新型CEC分離模式的基礎。
    固定相的選擇主要依據HPLC的理論和經驗。HPLC的各種固定相已被應用于CEC中，其中十八烷基硅烷鍵合硅膠固定相（ODS）應用zui多。CEC結合了HPLC和CE的動力優勢，不單純依靠壓力驅動毛細管柱中流動相的流動，還通過在毛細管柱兩端加上高壓直流電場所產生的電場力驅動，大大降低了柱內壓力。因此，CEC進行分析時，可使用內徑細小的毛細管柱和粒徑超小的填料（1.5～3μm），而不用擔心高反壓，大大提高了柱效和分離效果。實驗表明，只要固定相顆粒粒徑≥0.5μm，電滲流速度與固定相顆粒大小和填充均勻程度無關。
    分離手性化合物時，可在固定相上鍵合手性選擇劑，也可用非手性固體相在緩沖液中加入手性選擇劑進行拆分。
    混合官能團固定相是專門針對CEC研制的新型固定相，是在硅膠表面同時鍵合具有反相色譜性能的烷基官能團和具有離子交換性質的磺酸官能團，在很寬的pH范圍內都能保持良好的電滲流。
    六、流動相：
    根據固定相的正相和反相等特性，流動相可以是水溶液或有機溶液。常用流動相有乙腈－水、甲醇－水等。
    七、電色譜柱：
    電色譜柱是CEC的核心部件，按固定相形式不同可分為填充毛細管柱、開管毛細管柱和整體毛細管柱。
    1、填充毛細管柱：
    填充毛細管柱是將固定相填充到毛細管中，通過兩端燒結柱塞將固定相保持在毛細管中而成。其zui大優點是可利用眾多的HPLC固定相，根據化合物與固定相的作用不同實現分離，在CEC中應用zui廣泛。
    （1）制備方法：
    1）柱塞：
    柱塞制備對填充毛細管柱非常關鍵。
    ①柱塞必須滿足的要求：
    有足夠的機械強度，能承受填充時的高壓。
    化學惰性，耐有機溶劑和寬pH值的緩沖液。
    有合適的孔隙度，既不使流動相受阻，又可防止固定相顆粒通過。
    死體積小，避免峰展寬。
    ②柱塞制備方法：
    柱塞制作方法很多，目前應用較多的是水玻璃燒制法和填料直接燒制法。
    2）填充毛細管柱：
    填充毛細管柱的填充方法有高壓勻漿填充法、電動填充法和超臨界CO2法等。
    ①高壓勻漿填充法：
    高壓勻漿填充法是填充毛細管柱zui常用的制備方法。
    填充過程一般包括燒結進樣端柱塞、高壓填充、燒結出口端柱塞、除去不需要的固定相和檢測窗口制作等步驟。
    高壓勻漿填充法簡單，快速，但操作技術要求較高。由于在分離樣品時施加電場，會使表面帶電荷的固定相沿某一方向電泳，容易造成柱局部過于緊密產生較大的壓力，而局部由于固定相遷移形成較大的空隙。
    ②電動填充法：
    電動填充是利用電泳原理，使固定相在一定pH下帶電荷，在電場中定向移動而把固定相填充到毛細管中。與高壓勻漿填充法相比，電動填充法可有選擇地把荷質比相同的固定相填入毛細管中，柱床均勻。
    ③超臨界CO2法：
    超臨界CO2法是在毛細管柱一端制作臨時柱塞后，另一端與貯液罐相連，將預填充的填料放入貯液罐中，然后利用超臨界CO2將填料填入毛細管中，再緩慢釋放壓力至常壓而得到干的色譜柱。柱使用前用流動相潤洗，平衡。
    （2）特點：
    1）優點：
    ①柱效高。
    ②固定相資源豐富。
    2）缺點：
    ①存在柱塞制備和柱填充，步驟繁瑣。
    ②重現性差。
    （3）氣泡問題：
    填充毛細管柱CEC操作的困難是分離過程中常伴有氣泡產生。氣泡一般產生在柱塞與固定相交界處和柱塞與檢測窗口交界處。為了控制氣泡產生，目前主要采取以下措施：
    1）在柱兩端同時施加低壓，可較好的解決氣泡問題。
    2）制備滲透性好的柱塞。
    3）在分流閥處接一阻尼管，當電極處有氣泡產生時，氣泡會經分流閥通過阻尼管排出。
    4）利用超聲波使流動相和樣品充分脫氣。
    2、開管毛細管柱：
    開管毛細管柱是將固定相鍵合或涂敷在毛細管壁上，引入色譜分配機理。
    （1）制備方法：
    開管毛細管柱制備的關鍵是增大比表面積，以制備相比大和柱容量大的色譜柱。
    1）鍵合固定相。
    2）涂覆聚合物固定相。
    3）溶膠－凝膠法。
    4）分子印記法。
    （2）特點：
    1）優點：
    ①與填充毛細管柱相比，由于沒有渦流擴散，分離效率更高，分離時間大大縮短。
    ②由于不用柱塞，制備簡單，減小了氣泡產生的可能性。
    2）缺點：
    開管毛細管柱的相比是填充毛細管柱的1/350，柱容量小，對溶質的保留有限。
    為了增加相比和柱容量，開管毛細管柱一般使用比較細的毛細管（＜25μm），通過各種方法對管壁進行處理。
    3、整體毛細管柱：
    整體毛細管柱是采用有機和無機方法在毛細管中進行原位自由基聚合反應或固化，形成連續床固定相。目前是電色譜柱研究的熱點。
    整體毛細管柱一般采用柱內直接鍵合的方法形成整塊多孔的交聯聚合物，不用柱塞，簡化了柱制備過程。通過改變單體可引入多種官能團，有更好的多孔性和滲透性，對流動相阻力小，溶質在固定相和流動相之間快速分配，有利于實現高速分離。可對生物大分子進行快速分離。
    按基質不同可分為無機基質整體毛細管柱、有機基質整體毛細管柱、顆粒固定化整體毛細管柱和雜化材料整體毛細管柱。
    （1）無機基質整體毛細管柱：
    無機基質整體毛細管柱是通過溶膠－凝膠反應使硅烷化試劑形成牢固的Si－O－Si網絡骨架。溶膠－凝膠反應一般包括至少一種前導物質（通常是烷氧基硅烷）、溶劑、催化劑、有機添加劑和水，將這些物質的溶液引入經預處理的毛細管后，在柱中水解縮聚生成凝膠，然后進行老化、干燥，制成硅膠基質整體毛細管柱。
    在溶膠－凝膠反應過程中，催化劑HCl和單體含量對整體柱的結構有影響。增加HCl濃度可增加柱強度，增加分離效率。當HCl濃度低時，沒有足夠的硅醇基水解形成網絡骨架。增加單體和致孔劑的比率會減小孔徑，增加骨架密度，降低滲透性。當單體濃度小于5%時，單體只能與管壁結合，不能形成整體柱。當單體濃度大于18%時，柱滲透性非常差。
    溶膠－凝膠技術具有純度高、均勻性好和合成溫度低等特點，近年在材料科學領域得到了廣泛應用。
    硅膠基質整體毛細管柱機械強度良好，耐有機溶劑，硅膠骨架和通孔尺寸可獨立控制，但使用過程會出現收縮、開裂和干結等問題，很多情況下柱制備和修飾不能同時進行。
    另外，還有以氧化鋯和二氧化鈦為基質的整體柱，但這方面的研究遠不及硅膠基質整體毛細管柱廣泛和深入。
    （2）有機基質整體毛細管柱：
    有機基質整體毛細管柱有以聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯為基質的整體柱。典型的聚合液以含一個乙烯基的化合物為單體，以含兩個乙烯基的化合物為交聯劑，以含離子基團的化合物為產生電滲流的單體，為了形成多孔結構往往添加致孔劑。
    有機基質整體毛細管柱種類比較單一，機械強度較差，容易發生收縮和溶漲現象，使柱性能發生變化，影響柱壽命。
    1）聚丙烯酰胺基質整體毛細管柱：
    以聚丙烯酰胺為基質的整體柱從1995年出現以來得到了廣泛應用。zui初的整體柱一般以丙烯酰胺為單體，以亞甲基二丙烯酰胺為交聯劑，以含離子基團的化合物為產生電滲流的單體，所得到的整體柱是親水性較強的柱床。為了獲得疏水性較強的柱床，可添加疏水性較強的單體，如十四烯、十六烯和十八烯等，利用反相機制進行分離。
    2）聚甲基丙烯酸酯基質整體毛細管柱：
    以聚甲基丙烯酸酯為基質的整體柱是硬質柱床，柱制備比較簡單，毛細管壁可不經過預處理將聚合物混合液引入到柱中后，經水熱處理可得到柱體與管壁結合很好的整體柱。
    以2－（三甲基磺酸甲酯銨）乙基甲基丙烯酸酯（MEAMS）為單體，以乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯劑，以正丙醇和1，4－丁二醇的混合液為致孔劑，可得到具有反相和離子交換混合模式的整體柱。MEAMS中的銨基既作為產生反向電滲流的基團，又作為強離子交換固定相。該整體柱對中性化合物表現出反相色譜機制，對帶電荷的物質既有反相作用機制，又有離子交換作用機制。使用該整體柱分離堿性化合物時，還消除了一般電泳和電色譜中由于堿性化合物吸附所造成的峰拖尾現象。
    3）聚苯乙烯基質整體毛細管柱：
    以聚苯乙烯為基質的整體柱是硬質整體柱。目前單體種類比較少，一般是苯乙烯－二乙烯苯共聚物。
    （3）顆粒固定化整體毛細管柱：
    顆粒固定化整體毛細管柱是將填料的溶膠－凝膠懸浮液引入毛細管中進行原位聚合，或將填料顆粒填充到毛細管中后，再采用如高溫燒結、溶膠－凝膠等方式，形成連續床層的整體柱。由于顆粒的存在，減少了柱制備過程中的收縮和干裂。
    （4）雜化材料整體毛細管柱：
    采用有機－無機雜化的方法，使整體柱的形成和衍生同時完成。柱制備簡單，可通過調節不同前導物質的比例來調整疏水相在整體柱中的比例。
    八、檢測器：
    CEC的檢測器有紫外檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器、質譜檢測器和拉曼光譜檢測器等。
    九、特點：
    1、超分離：
    分離效率比HPLC高，25萬以上TP/m。
    2、超快速分離：
    30s內可完成4種樣品的分離。
    3、超高峰容量：
    3倍于HPLC的峰容量。
    4、超高分離精度：
    重現性與HPLC相媲美。
    5、超高選擇性：
    選擇性比CE高。
    6、梯度洗脫：
    微流控制系統顯著降低了體系的死體積，可實現高壓梯度洗脫，可分離分子結構相近或電泳淌度接近的混合物。
    7、定量進樣：
    納升級閥進樣，大幅度提高了進樣的準確性和重復性。
    8、微流化，環境友好：
    CEC的毛細管柱中流量為0.2～1μL/min，消耗溶劑和樣品量是HPLC的萬分之一。HPLC的進樣量為微升級，無法分析納升級樣品。CEC的進樣量只為納升級，過多的取樣量往往會致死本體，在活體取樣時體現出巨大優勢。
    與HPLC相比，CEC的分析時間更短、柱內徑更細、分離速度更快，使溶劑消耗量更少，由此產生的廢液更少，大大降低了成本，保護環境。
    十、應用：
    CEC為蛋白質組學、生物醫藥學、天然藥物分析、環境保護、食品安全和手性化合物分析等領域提供了創新的技術手段。填充毛細管電色譜在蛋白質分析中有重要潛力。