微核試驗是遺傳毒性研究標準組合試驗之一，在食品，化學品，藥品，農藥，飲用水等多類產品的遺傳毒性評價方面得到廣泛應用。與體內實驗相比，體外微核試驗更加簡單快速，避免動物個體差異影響，靈敏度高。體外微核試驗主要包括體外哺乳類細胞微核試驗，人外周血淋巴細胞微核試驗，肝原代細胞微核試驗等類別。
體外哺乳類細胞微核試驗是一種用于檢測哺乳類細胞在受試物處理后是否產生微核的遺傳毒性檢測方法。該試驗適用于檢測有絲分裂細胞暴露于受試物期間或之后致染色體斷裂和誘發非整倍體的能力。如果3h~6h短期處理的試驗結果為陰性或不確定時，需要進行無代謝活化系統的長期處理試驗，相當于用受試物處理細胞1.5個~2.0個正常細胞周期。
參考導則：
GB 15193.28-2020 食品安全國家標準 體外哺乳類細胞微核試驗
一、儀器、試劑
儀器
細胞培養箱、倒置顯微鏡、正置顯微鏡、超凈臺、離心機。
代謝活化系統
1.1 S9輔助因子的配制
1） 鎂鉀溶液
氯化鎂1.9 g和氯化鉀6.15 g加蒸餾水溶解至100 ml。
2） 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)
磷酸氫二鈉(Na2HPO4，28.4 g/L)440 mL,磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O,27.6 g/L)60 mL，調pH 至7.4，0.103 MPa 20 min滅菌或濾菌。
3） 輔酶-Ⅱ(氧化型)溶液
無菌條件下稱取輔酶-Ⅱ，用無菌蒸餾水溶解配制成0.025mol/L溶液，現用現配。
4） 葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液
稱取葡萄糖-6磷酸鈉鹽,用蒸餾水溶解配制成0.05 mol/L 溶液，過濾滅菌。現用現配。
1.2 大鼠肝S9組分的誘導和配制
選健康雄性成年SD或Wistar大鼠，體重150g~200g，約5周齡~6周齡。將多氯-聯-苯(Aroclor 1254)溶于玉米油中，濃度為200 g/L，按500 mg/kg體重無菌操作一次腹腔注射，5 d后處死動物，處死前禁食12 h。
也可采用苯巴比-妥-鈉和β-萘黃酮聯合誘導的方法進行制備，經口灌胃給予大鼠苯巴比-妥-鈉和β-萘黃酮，劑量均為80 mg/kg體重，連續3d，禁食16 h后斷頭處死動物。其他操作同多氯聯苯誘導。
S9組分制成后，經無菌檢查，測定蛋白含量(Lowry法)，每毫升蛋白含量不超過40 mg為宜，并經間接致突變劑鑒定其生物活性合格后貯存于-80°C低溫或冰凍干燥，保存期不超過1年。
1.3 S9混合液的制備
S9混合液濃度一般為1%~10%，實際使用濃度可由各實驗室決定，但需對其活性進行鑒定，必須能明顯活化陽性對照物，且對細胞無明顯毒性。
一般由S9組分和輔助因子按1:9組成10%的S9混合液，無菌現用現配。10%S9混合液10mL配制方法如下:取上述磷酸鹽緩沖液6.0
mL、鎂鉀溶液0.4 mL、葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液1.0 mL、輔酶 II溶液1.6 mL、肝S9組分1.0 mL，混勻，置冰浴中待用。
1.4 肌動蛋白聚合抑制劑細胞松弛素B(CytochalasinB，cytoB)溶液
用二甲基亞砜( DMSO)配制適當濃度的儲備液，避光冷藏保存。cytoB的終濃度通常為3μg/ mL ~6μg/mL，實驗室應根據各種細胞系選擇cytoB的適當終濃度，以達到理想的雙核細胞出現頻率。
1.5 0.075 mol/L氯化鉀溶液
5.59 g氯化鉀加蒸餾水至1000 ml。
1.6 固定液
甲醇:冰醋酸為3:1，臨用前配制。
1.7 姬姆薩(Giemsa)染液
取姬姆薩染料3.8 g ，置乳缽中，加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇至375 mL，待完全溶解后，再加 125 mL甘油，放入37° C溫箱中保溫48
h。保溫期間振搖數次，使充分溶解。取出過濾，2周后使用，作為姬姆薩染液原液。使用時,取1份姬姆薩染液原液，與9份1/15
mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)混合,配成其應用液.現配現用。
磷酸鹽緩沖液(1/15 mol/L，pH 6.8)配制方法如下：
1）第一液：取磷酸氫二鈉(Na2HPO4)9.47 g溶于1000 mL去離子水中，配成1/15 mol/L溶液；
2） 第二液：取磷酸二氫鉀(KH2 PO4 )9.07 g溶于1 000 mL去離子水中，配成1/15 mol/L溶液；
3） 取第一液50 mL加于第二液50 ml中混勻，即為pH 6.8的1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液。
二、 試驗方法
2.1受試物
固體受試物應溶解于適合的溶媒中，并稀釋至適當濃度。液體受試物可直接使用或稀釋至適當濃度使用。受試物應無菌現用現配，否則須確認儲存不影響其穩定性。
2.2 細胞
可選用中國倉鼠肺細胞株(V79、CHL)或卵巢細胞株(CHO)、小鼠淋巴瘤細胞株(L5178Y)、人外周血淋巴細胞株(如TK6)和原代培養細胞。推薦使用CHL或L5178Y細胞株。細胞在使用前應進行染色體數目穩定性和有無支原體污染的檢查。匯智泰康體外微核試驗試劑盒推薦使用中國倉鼠肺細胞株（CHL）。
2.3試驗方案選擇
試驗分為使用和不使用cytoB兩種方案。
方案一：在細胞經過受試物處理，有絲分裂前使用cytoB，然后觀察分析已完成一次有絲分裂的細胞(雙核細胞)微核率。當選用人類淋巴細胞時,建議采用方案一，因為不同來源的細胞周期不同，而且不是所有的細胞都對植物血球凝集素(PHA)有反應。
方案二：不使用cytoB，細胞經過受試物處理后觀察分析細胞微核率。如果有證據表明受試物干擾cytoB的活性，或cytoB可能影響細胞的生長(如小鼠淋巴瘤細胞株)，建議采用方案二。
2.4 劑量
1） 劑量設置
至少應設置3個檢測劑量。受試物沒有細胞毒性時，從最高劑量往下設至少2個劑量，一般情況下間隔系數可為2~3；有細胞毒性時，其劑量范圍應涵蓋從55%士5%的細胞毒性到幾乎無細胞毒性。
2） 最高劑量的選擇
決定最高劑量的因素是細胞毒性、受試物的溶解度以及pH、滲透壓。
受試物有細胞毒性時，最高劑量應能引起55%士5%的細胞毒性；如果沒有細胞毒性或沉淀，最高劑量應是5μL/mL、5 mg/ml或10 mmol/L。
對溶解度較低的物質.當達到最大溶解濃度時仍無毒性，則最高劑量應是在最終培養液中溶解度限值以上的一個濃度。在某些情況下，應使用一個以上可見沉淀的濃度，溶解性可用肉眼鑒別，但沉淀不能影響觀察。
3） 細胞毒性的確定，
在S9存在和不存在兩種條件下依據細胞完整性和生長情況的指標來確定細胞毒性。
方案一，使用cytoB，細胞毒性的確定可依據復制指數(ReplicationIndex,RI)或胞質分裂阻斷增殖指數( Cytokinesis Block Proliferation Index,CBPD)。
