細胞分布
我們之前比較了iCELLis
Nano生物反應器高壓縮固定床（4m2）和低壓縮固定床（2.67m2）中的細胞分布，發現在低壓縮中，細胞分布更加均衡。在高壓縮固定床中，細胞分布有較大的差異，取決于計數的細胞來自哪一層（相比頂部，底部的細胞量要高3到4倍）。盡管在低壓縮固定床中，差異性較小，我們還是注意到，相比底部，低壓縮床中部的細胞量要高2到3倍。對拆卸的scale-X生物反應器進行了細胞密度分析，以了解固定床不同部分中的細胞分布（圖1）。結果發現，在整個固定床中，細胞分布相比均衡（圖1）。但是，當垂直或水平分析時，固定床中部的細胞密度要高約2倍，這與低壓縮iCELLis生物反應器中的結果較為接近。當對雙層膜的外膜和內膜進行細胞密度分析時，發現差異很小。這可能是由于scale-X生物反應器固定床的卷式膜樣結構形成了批次間細胞密度以及細胞生長更低的變異性。相比scale-X生物反應器，iCELLis生物反應器中，特別是在高壓縮固定床中，細胞密度更高的變異性，可能是由于載體相對隨機且緊實的填充。所以，在iCELLis生物反應器中，由于存在一些低致密和高致密區域，每個反應器之間總是有差異。
此外，在拆解前，對拆解的生物反應器的采樣條進行取樣，計算密度為~1.1x10^5cells/cm2，接近膜頂-中部的密度（1.2x10^5±0.4x10^4）。所以，可見scale-X生物反應器中的采樣條具有代表性，可用于評估細胞密度。
細胞生長
對于iCELLis Nano系統，我們優化了接種使用的細胞密度，所以，在第0天，對照的Nano系統以7,000 293T
cells/cm2的密度接種。對于scale-X生物反應器，使用兩種不同接種密度，7,000
cells/cm2（scale-X生物反應器運行1-3）以及9,000
cells/cm2（scale-X生物反應器運行4）。在兩種生物反應器中，細胞均可很快貼附至PET內層，因為接種后1h，生物反應器的培養基取樣中，未發現游離細胞。感染時的目標細胞密度為150,000-200,000
cells/cm2，且通常，在iCELLis Nano運行中，該密度可在4天內達到。為監測細胞生長，iCELLis
Nano和scale-X生物反應器可在層流罩內打開，使用無菌鑷子從生物反應器夾取載體（Nano 生物反應器）或采樣條（scale-X
生物反應器）。重要的是，在scale-X生物反應器系統更大尺寸的固定床中，也可以通過采樣條取樣，而iCELLis 500生物反應器中的載體不能取樣。
計算在第1-4天（轉染前）從生物反應器固定床頂部取樣的載體/采樣條的細胞核，并轉換為細胞密度（圖2a）。scale-X生物反應器運行3中達到目標細胞密度，scale-X生物反應器運行1和2接近達到目標細胞密度。scale-X
運行4中更高的接種細胞密度導致轉染時的細胞密度過高。可能是由于整合固定床中不均勻的細胞分布，對照Nano運行也超過了目標細胞密度。
葡萄糖和培養基消耗
在所有運行中，使用灌流提供新鮮培養基。目標是通過使用高-葡萄糖DMEM作為灌流培養基，而維持生物反應器中0.5g/L的葡萄糖濃度。為調節灌流速率，每天從生物反應器培養基取樣監測葡萄糖和乳酸濃度（圖2b、c）。盡管在scale-X生物反應器運行1和2中，培養基和葡萄糖消耗低于標準iCELLis
Nano運行，在運行3和4中，葡萄糖和培養基消耗在iCELLis
Nano范圍內（圖3）。值得考慮的是，在運行4中，相比其它運行，接種使用了更高的cells/cm2值。當計算感染前數值時，相比對照或標準iCELLis
Nano運行，所有scale-X運行中的細胞特異性葡萄糖消耗最多可降低4倍（圖3i）。如果考慮到細胞密度在轉染后不發生變化，則可以評估收獲前的細胞特異性葡萄糖消耗（圖3j）。相比標準iCELLis
Nano運行，scale-X生物反應器運行中的細胞特異性葡萄糖消耗低達3倍。但是，這必須考慮到兩種生物反應器類型中，整個固定床內不同的細胞密度，而且細胞特異性葡萄糖消耗僅根據采取的頂部載體進行計算。這反應了scale-X生物反應器中更低的培養基/葡萄糖消耗。特別是，如果在24hPT前，灌流速率降低，成本可進一步降低，因為需要的昂貴FBS的體積更小（在我們的方案中，從24h
PT開始，FBS不用于灌流培養基）。此外，灌流中更低的培養基消耗可降低收獲液體積，這有益于下游工藝處理。Scale-X生物反應器中更低的葡萄糖/培養基消耗的原因只能推測，但部分可能是由于scale-X中更加均勻的固定床結構。而且，在scale-X生物反應器中，循環的培養基可能可更加均等地達到細胞。
基于iCELLis Nano和scale-X中的總培養基消耗，如果直接放大至含有333m2固定床的iCELLis 500，灌流總共將使用大概~150L培養基，而含有600m2固定床的scale-X nitro中消耗的體積將為670 至940L。
圖2. scale-X hydro生物反應器和iCELLis Nano生物反應器運行中的細胞密度以及葡萄糖和乳酸濃度。（a）第0-4天，計算的固定床頂部的細胞密度（cells/cm2）；第0-7天，（b）葡萄糖和（c）乳酸濃度。對照Nano = Nano運行，運行與scale-X生物反應器運行一起進行。標準Nano = 5個標準Nano運行的平均值。Scale-X 1-4 = scale-X生物反應器運行1-4。
圖3. scale-X hydro 生物反應器和iCELLis Nano生物反應器運行中，培養基和葡萄糖消耗的散點印跡圖。（a、b）轉染前的培養基消耗，以mL（a）和μL/cm2（b）為單位；（c、d）收獲前運行中總培養基消耗，以mL（c）和μL/cm2（d）為單位；（e、f）轉染前的葡萄糖消耗，以g（e）和mg/cm2（f）為單位；（g、h）收獲前的總葡萄糖消耗，以g（g）和mg/cm2（h）為單位；（i、j）轉染前（i）和收獲前（j）的細胞特異性葡萄糖消耗，以pmol/cell/day為單位，考慮轉染后，細胞密度不增加。標準Nano=5個用于慢病毒載體生產的iCELLis Nano運行，對照Nano=與scale-X生物反應器運行一同進行的運行。Scale-X 1-4=scale-X生物反應器運行1-4，其中，運行1未轉染，而在第4天停止運行并拆解固定床。對于每個運行，標準Nano運行標識為獨立的點；此外，顯示SEM和中位數。SEM，標準平均誤差。
在iCELLis Nano和scale-X生物反應器中的慢病毒載體產量
在scale-X生物反應器和對照/標準Nano運行中，以p24
ELISA分析的病毒顆粒滴度以及以基于qPCR的方法分析計算的感染性滴度均在相同的范圍內（圖4a-d）。在獨立的分析中分析的感染性滴度不能可靠地相互比較，但是，如滴度檢測同時進行，則可以進行比較。對照Nano和scale-X生物反應器運行3和4同時進行滴度檢測，在這些運行中，scale-X生物反應器中的生產的TU幾乎是iCELLis Nano運行的兩倍多。由于scale-X生物反應器中的固定床尺寸相比iCELLis
Nano小，所有每cm2的TU差異更大（圖4d）。在所有的運行中，VP產量彼此接近（圖4a、b），所以，基于這些運行，scale-X生物反應器運行3中的vp/TU比（vp/TU：652）好于iCELLis
Nano（vp/TU：1339）生物反應器。但是，在轉染過程中，按細胞核計數，iCELLis
Nano生物反應器中的細胞密度約為目標的兩倍。由于接種的細胞量與標準運行相同，所以可能的解釋是固定床中細胞的不均勻分布，其可能降低了轉染效率，進而影響產量。如scale-X生物反應器運行4當中所見，至少接種9,000
cells/cm2更高的細胞密度時，不會提高產量，7,000
cells/cm2似乎是scale-X生物反應器中的最佳接種密度。由于所有scale-X生物反應器運行中的產量與iCELLis
Nano（對照和標準運行）相比，至少相似或甚至更高，所以iCELLis
Nano生物反應器中使用的參數可相對簡單地轉移到scale-X生物反應器，而不需要針對另一種固定床進行參數優化。但是，優化后可能可進一步提高滴度。
我們之前注意到，相比低壓縮的固定床，在高壓縮固定床進行生產時，每cm2的慢病毒載體產量要低。在2.67m2低壓縮固定床的iCELLis
Nano生物反應器生產的病毒載體量與4m2高壓縮固定床中的產量相同。此外，使用低壓縮固定床時，培養基消耗更低，且更容易預測。所以，使用當前的iCELLis
500，理論上可達到1-2x10^12TU（使用qPCR方法，在HeLa細胞中進行滴度檢測）或1-3x10^15VP（病毒顆粒）的總產量。目前，最大的低壓縮iCELLis固定床尺寸為333m2。對于scale-X生物反應器，其只提供一種壓縮。根據scale-X生物反應器生產商的信息，其可提供的最大固定床尺寸至少為600m2。所以，如果使用scale-X生物反應器系統，進行直接規模放大，iCELLis生物反應器中生產的病毒載體量至少可以翻倍，甚至翻三倍。但是，我們發現，盡管iCELLis生物反應器系統應該可以直接規模放大，但是出于未知的原因，當慢病毒載體生產從iCELLis
Nano規模放大到iCELLis
500規模（使用100或333m2）時，相比小規模，每m2生產的病毒載體更多，而在大規模中，每m2消耗的培養基更少。所以，如果大規模中的產量提升與生物反應器固定床的組成無關，而與其它大規模工藝參數相關，如無抗生素生產，而相同的情況也發生在大規模scale-X生物反應器中，則scale-X
nitro 生物反應器中可能可達到超于>1x10^13 TU（在我們的HeLa細胞中進行滴度檢測）或超于 >1x10^16vp。
由于iCELLis和scale-X生物反應器均旨在貼壁使用，所有其可放大性確實有限。使用懸浮生物反應器時，可放大性限制較少，例如，使用2,000L懸浮生物反應器可極大地提高產量。目前，很多慢病毒載體批次，甚至是用于臨床試驗時，仍使用細胞工廠、3L攪拌罐或僅達50L的波浪式生物反應器或攪拌罐進行生產。但是，僅有極少數的病毒載體生產商報導了更大的懸浮生物反應器的使用。在貼壁生物反應器中，如iCELLis和scale-X生物反應器系統，可通過灌流，簡單地提供新鮮的培養，并去除用過的培養基。由于慢病毒載體生產后進入培養基，灌流可以簡單地收集病毒載體，并實現連續的下游工藝處理。盡管懸浮生物反應器有灌流選項，懸浮中的灌流仍處于其早期研發階段，且用于慢病毒載體生產的合適灌流設備仍需要在臨床/商品化規模中進行優化或證實。此外，懸浮生物反應器中的泡沫形成對于病毒載體生產是個不小的問題。而且，在無血清培養基中生長的細胞或甚至是適應懸浮培養的細胞，仍可在固定床生物反應器中生長，因為細胞不管怎樣都會被截留在固定床的膜結構中。所以，簡單且溫和的灌流以及不需要額外設備的優勢，也可使用固定床生物反應器在無血清條件下以及懸浮馴化細胞中進行探索。
使用我們目前的參數，當規模放大至scale-X nitro生物反應器（600m2）時，根據灌流速率，理論上可生產400 至
600L的慢病毒載體，且病毒產量超于 >10^6 TU/mL（使用我們的HeLa細胞系進行滴度檢測）和超于 >10^9
vp/mL。這與使用補料分批的200L
攪拌罐生物反應器相當，其可達到0.5-5x10^7TU/mL感染性滴度。但是，由于沒有慢病毒載體參考標準，實驗室和生產站點間的感染性滴度不能進行完全的比較。此外，通常情況下，貼壁細胞中的慢病毒載體產率高于懸浮生產。這可能是由于不同的細胞培養基，因為特定的培養基相比其它培養基，可更好地支持轉染，獲得更高的產量。也可能部分是由于FBS的存在，其仍常用于貼壁細胞生產（在我們的整體方案中，直到轉染后24h前使用）。此外，不是所有用于生產慢病毒的載體都可在懸浮培養中良好生長。大體積的慢病毒載體收獲液可能難以進行下游處理。每個慢病毒載體生產商都應該考慮下需要多大體積的載體以及如何簡單且快速地對易碎的慢病毒進行下游處理。即使下游工藝處理之后的收率僅為10%，以scale-X
nitro（600m2）生物反應器生長的病毒載體的量，根據目的應用，已經可以達到數百至數千的劑量。但是，對于其它病毒載體的生產，例如AAV，還是需要更大的生物反應器，因為每個患者需要的病毒載體的數量通常高于慢病毒載體。
圖4. scale-X hydro生物反應器和iCELLis Nano生物反應器運行中的慢病毒載體產量。（a、b）scale-X生物反應器和iCELLis Nano生物反應器運行中，分別生產的總慢病毒顆粒（vp）和vp/cm2。（c、d）scale-X生物反應器和iCELLis Nano生物反應器運行中，分別生產的總TU和TU/cm2。對照Nano = Nano 運行，與scale-X生物反應器運行一同進行。標準Nano = 5個標準Nano運行的平均值。scale-X 1-4=scale-X生物反應器運行1-4。平均值±SEM。TU，轉導單位；VP，載體顆粒。
在iCELLis Nano和scale-X生物反應器中進行腺病毒載體生產
除了慢病毒載體之外（圖4），我們也比較了在iCELLis生物反應器和scale-X生物反應器中進行的腺病毒載體的生產。使用HPLC分析scale-X
hydro系統和iCELLis
Nano生物反應器生產的AdGFP的滴度。澄清后，scale-X生物反應器運行獲得的滴度為每毫升1.11x10^11病毒顆粒，iCELLis
Nano運行為每毫升8.53x10^10顆粒。結果說明，scale-X生物反應器也可用于腺病毒載體的生產，且獲得與iCELLis系統相當的高產量。
結論
Univercells的scale-X固定床生物反應器證實可高效用于病毒載體生產。通過細胞核計數、葡萄糖消耗和乳酸生產，監測細胞生長。補液策略基于灌流。在scale-X生物反應器中，細胞生長良好，且在整個螺旋纏繞管式固定床中，細胞分布相對均勻。慢病毒載體可在scale-X hydro系統中高效生產，與iCELLis Nano相比，scale-X生物反應器中生產的慢病毒載體產量相似甚至更高（總量為2.4x10^10
TU，即9.8 x 10^5
TU/cm2）。在對照的iCELLisNano中，獲得的產量為1.3x10^10TU（4.7x10^5TU/cm2），而在標準的iCELLis
Nano中，為1.7x10^10±SD 8.7x10^9TU（=6.4x10^10±SD
3.4x10^5TU/cm2）。此外，腺病毒載體產量在兩種生物反應器中相似，iCELLis Nano為8.53x10^10
vp/mL，scale-X hydro為1.11x10^11vp/mL。所以，可見，iCELLis生物反應器中用于病毒載體生產的參數可直接轉移到scale-X生物反應器上，反之亦然。
原文翻譯：H.M.Leinonen, S.Lepola, E.M.Lipponen, et al.,
Benchmarking of Scale-X Bioreactor System in Lentiviral and Adenoviral
Vector Production. Human Gene Therapy, 2020, 31(5&6) : 376 – 384.
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