定量PCR 定義 以參照物為標準對PCR終產物進行分析或對PCR過程的進行監測，來評估樣本中靶基因的拷貝數，稱為定量PCR相對定量→絕對定量， 手工操作→自動化檢測， 靈敏度與特異性多有很大的提高。 定量PCR的可行性 定量一般是在PCR擴增的指數期進行的。 特定的待擴增基因片段 起始含量越大，則指數擴增過程越短 當擴增速率趨于穩定后，則無論原來樣品中起始模板含量多少，擴增片段的含量通常是一樣的。 理想的擴增結果：Y=A×2n Y為擴增產物量 A代表PCR反應體中的原始模板數 n為擴增次數 理論上PCR擴增效率應為100%，PCR產物隨著循環的進行成指數形成增長 實際上：DNA的每一次復制都不完全，即每一次擴增中，模板不是呈2倍增長。 Y= A（1+R）n R 代表擴增效率： R = 參與復制的模板/總模板 R在整個PCR擴增過程中不是固定不變的。 A 在 1～105拷貝,循環次數n≤20次：R 相對穩定，原始模板以相對固定的指數形式增加，適合定量分析 隨著循環次數n的增加（>20次），R值逐漸減少，Y 呈非固定的指數形式增加，最后進入平臺期 PCR反應的后期：PCR產物的指數形式增長→線性增長→平臺效應 控制： 原始模板的濃度范圍 循環次數 通過PCR產物量計算原始模板量是完全可行的。 分類 根據反應體系是否設有參照物以及是否與標本在同一管中進行擴增，定量PCR可分為四種方法： ①有限稀釋法，即倍比稀釋法； ②使用外參照物的定量PCR ③使用非競爭性內參照物的定量PCR ④使用競爭性內參照物的定量PCR 根據PCR擴增過程中是否加入某種標記物、標記物的種類以及最后檢測的信號的不同可分為四種類型： ①直接定量檢測法， ②同位素標記定量檢測法， ③酶標記定量檢測法 ④熒光定量PCR技術 PCR過程的監測檢測模式 （1） R Green I 檢測模式 （2） 水解探針模式 （3） 雜交探針模式 （1） R Green I 檢測模式 溫度循環為94～55～72℃三步法 只有引物，無探針 熒光染料鑲嵌在雙股螺旋鏈中間。通過對特定方向的強熒光檢測獲得信號 易產生非特異信號，且本底光較大。 （2） 水 解探針模式 （Taqman）Hydrolysis Probe 溫度循環為94～60 ℃ 二步法 有引物 一個探針（引物對之間） 增加了檢測信號的特異性 （3） 雜交探針模式 （Hybridization Probes） 溫度循環為94～55～72 ℃ 三步法 有引物 二個相鄰的特異探針（引物對之間） 一．對PCR產物的直接定量法 基本方法：通過測定樣本的產物量，推測樣本中起始靶分子的相當數量。對已知量的靶DNA作系列稀釋，摸索出不同循環數不同稀釋度的PCR產物含量，建立外源性標準作對照。 優點：簡單，可作粗糙的定量分析。 缺點：不準確，影響因素多。 二．極限稀釋法 原理： 通過稀釋陽性樣品直至靶基因不能再擴增為止 設置已知濃度的參照品 根據陽性結果的最大稀釋度及內參標或外參標的極限檢出底線，計算出待檢標本中原始模板的分子數 利用最大稀釋度來進行標本核酸的定量 注意點 ①PCR產物的最低可檢測極限須有重復性。 ②對每個稀釋度必須作多次PCR 一般先對模板 DNA作10倍連續稀釋后作PCR，首先找到 PCR結果呈陰性的接近稀釋點 ，然后再對各稀釋度作系列的2倍稀釋，每個稀釋點作5次PCR。 ③必須嚴格控制污染 優點：不需要特殊設備。 缺點：擴增反應條件的標準化；嚴格注意污染，避免假陽性的產生。 原理：同樣反應條件，同一試管內，用兩對引物，同步擴增來自同一DNA的一段靶序列和另一段內標序列。通過比較兩種序列的擴增產量可對靶序列定量。 方法： ① 設計并合成PCR擴增靶基因及無關基因的引物，優化引物配比的條件。 ② 在指數增長期實現對靶基因及一系列已知含量無關基因的PCR擴增。 ③ PCR產物瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。 ④ 電泳條帶的紫外光下分析。 ⑤ 二者熒光強度相等管的DNA含量亦相等。 該方法只有當靶序列和內標序列以相同的量存在時，才能對兩者相對定量； 對處于擴增指數期的PCR產物定量。 四．競爭性PCR法 原理：同樣的反應條件，同一個試管，用同一對引物，同步擴增靶序列和內參照序列。靶基因的量可通過與產生相同產物的競爭物的量相比較而得到。其基本條件是靶序列和競爭性序列均用相同的引物以相同的效率擴增，兩序列的初始化比值在整個反應過程中保持不變。 目的DNA 內參照DNA 變性（同一對引物） PCR 競爭性模板的設置： 通過改變克隆的靶基因的序列來設計競爭性模板 插入新的限制性酶切位點或使原來的酶切位點缺失 通過基因重組技術插入一個與特異性蛋白結合的DNA片段，或者使靶序列發生定點誘變 人工合成競爭性模板 競爭性模板設計目的：使其與靶基因的PCR擴增產物相區別（酶切、雜交、顯色等） 競爭性定量PCR的分類： 根據競爭性模板與靶基因的PCR產物區別的方法可分為 雜交法 酶切法 改變競爭性模板的長度 （一）限制性內切酶切割法 競爭性模板的制備：通過定點誘變使靶基因中限制性內切酶的作用位點缺失或增加新的限制性內切酶的作用位點，然后將其克隆入pUC或pGEM中，得到競爭性內參標模板。 競爭性PCR擴增 對PCR產物作限制性內切酶的切割 酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色 設標準品系列對照。 結果判斷: 紫外光下觀察： 各泳道的電泳條帶數及其熒光強度，與標準品作對照 找出靶基因與競爭性模板熒光強度相同的標準管 該標準管中靶基因的初始量與待測管中待測模板的初始模板數應相同。 （二）雜交檢測法 競爭性模板的制備：通過定點誘變在靶基因序列中造成部分序列缺失或增加部分序列，作克隆及測序。 雜交探針的制備：針對該突變序列設計雜交探針，并進行標記（同位素，酶，地高辛等）。 待測樣品的定量： 利用PCR擴增估計待測模板的濃度范圍 調節其濃度（與競爭模板濃度相等或相近）作競爭性PCR 從標準曲線查其濃度。 （三）改變競爭性模板的長度 制備競爭模板：在兩條引物結合區間內引入或缺失部分序列 靶基因與競爭性模板的PCR擴增產物的分子大小不同，在普通瓊脂糖凝膠電泳中出現相互分離的條帶。 優點：能有效地控制擴增效率的管間和樣本間的誤差，是一種靈敏度較高，能比較客觀反映標本初始狀態時核酸模板含量的方法。 缺點：可能有假陽性。擴增效率可能不同。競爭性模板的構建和試驗需大量時間。 五 固相雜交酶免疫法 (PCR-ELISA) 生物素～引物 擴增 親和素—生物素～DNA—探針DNA～Dig （包被） （雜交） -----抗Dig～POD ------ 底物顯色 原理: 生物素標記引物，地高辛標記的探針 標有生物素PCR產物與地高辛標記的探針雜交 鏈酶親和素固相包被 雜交雙鏈的生物素基團與固相包被的鏈酶親和素結合 基團與隨后加入POD-抗Dig結合 POD作用底物呈色酶標儀檢測，顯示待測樣品中核酸模板含量。 優點:靈敏度較高，特異性好，避免假陽性，結果準確可靠，且成本不高，有利于推廣和普及 缺點20061215215849134.gifCR體系不同管之間不同的模板提取效率、逆轉錄效率和擴增效率等因素的影響，故酶標結果不能完全客觀地表示模板含量;且酶免疫顯色反應的線性測定范圍狹窄。 六.微板核酸雜交(三明治雜交) 固相雜交酶聯法+PCR極限稀釋法 原理:特異性探針包被于微孔板內,與待測核酸產物進行雜交,再用一顯色探針與待測核酸的另一區域進行雜交;將一定濃度的標準品計算直線回歸方程及繪制標準曲線,根據待測樣品顯色的光密度值推算出該樣品的核酸濃度 捕獲探針DNA — PCR DNA—酶標探針DNA （雜交） （雜交） —底物顯色 優點: 1)排除非特異性擴增所致假陽性 2)在一定濃度范圍內核酸模板量與顯色光密度值呈良好線形關系 3)信號檢測方便 缺點: 存在擴增后的污染 七．熒光定量PCR 主要原理：熒光共振能量轉移(FRET) 外來光源激發供體熒光染料發出熒光 當其發射波長與受體熒光染料的吸收波長部分重疊，且兩者距離很近(約10～100埃)時：受體熒光染料吸收供體熒光傳遞的能量而激發出另一波長的熒光，同時將供體熒光淬滅。 常用于技術有三種： FRET技術 分子信標技術 Taqman.技術。 FRET技術 (Ligthtcycler技術瑞土Roche公司) 采用了兩條相鄰熒光探針 供體探針，受體探針 供體熒光探針的5’端和受體熒光探針的3’端分別標記不同的熒光素分子 兩探針與模板DNA鏈雜交時，相鄰很近(約10～100埃)，借助于FRET原理，受體熒光素分子吸收供體熒光所傳遞的能量，其報告基團發出一定波長的熒光，同時將供體熒光淬滅。 檢測第二熒光信號 實時熒光定量PCR儀 LightCyclerTM 分子信標技術 新型熒光標記核酸探針，它可以在DNA序列擴增的同時進行探針雜交并顯示其過程。 分子信標技術可應用于實時定量PCR測定靶基因濃度。 Taqman技術 兩條普通引物，一條熒光標記探針 熒光標記探針: 5端：信號基團（Reporter），單獨存在時可以發光； 3端：抑制基團（Quencher）,其存在時可抑制信號基因的功能，不產生發光現象。 熒光PCR反應的實現 定量依據： 在PCR擴增特定基因時，反應體系中原始模板數愈多，到達平臺期所需的循環數愈少；原始模板數愈少，到達平臺期所需的循環次數愈多。 將不同濃度的原始模板數對PCR擴增到檢測閾值所需的循環次數（Ct值）作圖，便得到一個標準曲線 7700型定量PCR儀 Taq Man試劑盒（PE USA） 熒光定量PCR的過程 樣品常規處理 → 加入反應管,設置陰,陽性對照 → PCR儀擴增 →電腦分析后給出結果 優點 準確定量,定量范圍寬; 特異性強,克服了假陽性的主要來源; 操作快速,無須做梯度稀釋,無須PCR后處理; 技術簡單,安全. 缺點 設備昂貴，難以普及 八．免疫PCR 原理：與ELISA基本相似。不同處： 1）標記物：一段任意的DNA分子而不是酶； 2）操作過程：有PCR擴增及DNA檢測過程，無酶顯色過程。 免疫PCR主要由兩個部分組成 第一部分類似于抗原、抗體反應的酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 第二部分為PCR擴增與檢測。 一般程序：酶標板內包被捕獲抗原的抗體，加入待測抗原孵育后洗滌，加入DNA標記的檢測抗體，孵育后洗滌，PCR擴增粘附在抗體/抗原復合物上的DNA分子，電泳顯示結果。 反應層次： 抗體---待測抗原---抗體—蛋白A～親和素--生物素～DNA---PCR---電泳 特點 ①具有抗原、抗體反應的特異性和PCR的高敏感度，靈敏度約比ELISA高10倍； ②極為敏感的抗原檢測技術，適用于微量蛋白質的檢測； ③能同時對儚種抗原成分進行檢測； ④可直接用于檢測細胞表面的微量抗原； ⑤可分為直接免疫PCR與雙抗體夾心免疫PCR； ⑥可進行自動化操作。 關鍵：如何將抗體與標記用DNA連接，建立抗原、抗體與DNA的量的對應關系，從而將抗原的檢測轉化為DNA的檢測。 抗體與DNA連接 間接法 通常是通過親和素為橋梁，將生物素化的抗體與生物素化DNA連接。 由于在檢測過程中需加入親和素和生物素化DNA，洗滌步驟繁瑣。 ssDNA與抗體的直接連接 通過異雙功能化學絞聯劑制備DNA—抗體偶連物，ssDNA與抗體的Fc段連接。 該法不影響抗體活性，能避免間接法繁瑣的洗滌步驟，而且能同時進行多種抗原的檢測 人工合成的ssDNA的長度不能超過100bp. dsDNA與抗體的直接連接 比ssDNA與抗體的直接連接法更具優越性，dsDNA的長度可達幾千個bp，dsDNA比ssDNA更穩定，更易進行熒光家以及其他非同位素的標記。 免疫PCR擴增產物的檢測 早期:定性或半定量檢測 凝膠電泳，EB染色， 近年:定量檢測 同位素標記定量PCR技術 酶標記定量PCR技術 熒光定量PCR技術等。 優點：特異性強，敏感性高，不需特殊儀器 缺點：本底高，連接分子來源不便。 ①直接定量法 ②極限稀釋法 ③內參照法 ④競爭性定量PCR ⑤微板雜交法 ⑥PCR-ELISA法 ⑦熒光定量PCR ⑧免疫PCR 九．生物芯片(Biochip) DNA芯片(DNA ChiP) 寡核苷酸微芯片(Oligonucleofide Microchip) 基因芯片(Genechip) DNA陣列(DNA Array) 生物芯片的研究及其技術開發 20世紀90年代初：美國Affymetrix公司的Steve Fodor博士決定將硅技術與生物學技術融合在一起，借助半導體技術進行DNA芯片的研究 生物芯片技術診斷原理 基本過程： 病人的血液或漱口水或羊水→提取DNA→熒光／核素標記→滴在基因芯片→與基因芯片上相對應的基因發生結合→掃描檢測→計算機識別疾病的基因 芯片的面積只有指甲蓋大小(1—2平方厘米)，將其嵌在一小塊黑色膠片上，在上面鋪上一層肉眼看不見的DNA纖維，即DNA小探針，將需要被檢測的基因提取出來后，切成長短不一的片段，用熒光化學物標記，檢測時將標記過的熒光物質加在芯片上，與芯片上的大量探針進行雜交，標記過的DNA受激光光束激發后發出熒光，熒光的強弱與探針雜交程度相關。 圖像分析： 用熒光顯微鏡裝置對片基進行掃描，計算機收集熒光信號，并對每個點的熒光強度數字化后進行分析，通過特制軟件對不同區域熒光信號在芯片上組成的譜型分析可得出DNA序列及其變化的情況。
