電子顯微鏡 電子顯微鏡是根據電子光學原理，用電子束和電子透鏡代替光束和光學透鏡，使物質的細微結構在非常高的放大倍數下成像的儀器。 電子顯微鏡的分辨能力以它所能分辨的相鄰兩點的最小間距來表示。20世紀70年代，透射式電子顯微鏡的分辨率約為0.3納米(人眼的分辨本領約為0.1毫米)。現在電子顯微鏡最大放大倍率超過300萬倍，而光學顯微鏡的最大放大倍率約為2000倍，所以通過電子顯微鏡就能直接觀察到某些重金屬的原子和晶體中排列整齊的原子點陣。 1931年，德國的克諾爾和魯斯卡，用冷陰極放電電子源和三個電子透鏡改裝了一臺高壓示波器，并獲得了放大十幾倍的圖象，證實了電子顯微鏡放大成像的可能性。1932年，經過魯斯卡的改進，電子顯微鏡的分辨能力達到了50納米，約為當時光學顯微鏡分辨本領的十倍，于是電子顯微鏡開始受到人們的重視。 到了二十世紀40年代，美國的希爾用消像散器補償電子透鏡的旋轉不對稱性，使電子顯微鏡的分辨本領有了新的突破，逐步達到了現代水平。在中國，1958年研制成功透射式電子顯微鏡，其分辨本領為3納米，1979年又制成分辨本領為0.3納米的大型電子顯微鏡。 電子顯微鏡的分辨本領雖已遠勝于光學顯微鏡，但電子顯微鏡因需在真空條件下工作，所以很難觀察活的生物，而且電子束的照射也會使生物樣品受到輻照損傷。其他的問題，如電子槍亮度和電子透鏡質量的提高等問題也有待繼續研究。 分辨能力是電子顯微鏡的重要指標，它與透過樣品的電子束入射錐角和波長有關。可見光的波長約為300～700納米，而電子束的波長與加速電壓有關。當加速電壓為50～100千伏時，電子束波長約為0.0053～0.0037納米。由于電子束的波長遠遠小于可見光的波長，所以即使電子束的錐角僅為光學顯微鏡的1％，電子顯微鏡的分辨本領仍遠遠優于光學顯微鏡。 電子顯微鏡由鏡筒、真空系統和電源柜三部分組成。鏡筒主要有電子槍、電子透鏡、樣品架、熒光屏和照相機構等部件，這些部件通常是自上而下地裝配成一個柱體；真空系統由機械真空泵、擴散泵和真空閥門等構成，并通過抽氣管道與鏡筒相聯接；電源柜由高壓發生器、勵磁電流穩流器和各種調節控制單元組成。 電子透鏡是電子顯微鏡鏡筒中最重要的部件，它用一個對稱于鏡筒軸線的空間電場或磁場使電子軌跡向軸線彎曲形成聚焦，其作用與玻璃凸透鏡使光束聚焦的作用相似，所以稱為電子透鏡。現代電子顯微鏡大多采用電磁透鏡，由很穩定的直流勵磁電流通過帶極靴的線圈產生的強磁場使電子聚焦。 電子槍是由鎢絲熱陰極、柵極和陽極構成的部件。它能發射并形成速度均勻的電子束，所以加速電壓的穩定度要求不低于萬分之一。 電子顯微鏡按結構和用途可分為透射式電子顯微鏡、掃描式電子顯微鏡、反射式電子顯微鏡和發射式電子顯微鏡等。透射式電子顯微鏡常用于觀察那些用普通顯微鏡所不能分辨的細微物質結構；掃描式電子顯微鏡主要用于觀察固體表面的形貌，也能與 X射線衍射儀或電子能譜儀相結合，構成電子微探針，用于物質成分分析；發射式電子顯微鏡用于自發射電子表面的研究。 透射式電子顯微鏡因電子束穿透樣品后，再用電子透鏡成像放大而得名。它的光路與光學顯微鏡相仿。在這種電子顯微鏡中，圖像細節的對比度是由樣品的原子對電子束的散射形成的。樣品較薄或密度較低的部分，電子束散射較少，這樣就有較多的電子通過物鏡光欄，參與成像，在圖像中顯得較亮。反之，樣品中較厚或較密的部分，在圖像中則顯得較暗。如果樣品太厚或過密，則像的對比度就會惡化，甚至會因吸收電子束的能量而被損傷或破壞。 透射式電子顯微鏡鏡筒的頂部是電子槍，電子由鎢絲熱陰極發射出、通過第一，第二兩個聚光鏡使電子束聚焦。電子束通過樣品后由物鏡成像于中間鏡上，再通過中間鏡和投影鏡逐級放大，成像于熒光屏或照相干版上。 中間鏡主要通過對勵磁電流的調節，放大倍數可從幾十倍連續地變化到幾十萬倍；改變中間鏡的焦距，即可在同一樣品的微小部位上得到電子顯微像和電子衍射圖像。為了能研究較厚的金屬切片樣品，法國杜洛斯電子光學實驗室研制出加速電壓為3500千伏的超高壓電子顯微鏡。 掃描式電子顯微鏡的電子束不穿過樣品，僅在樣品表面掃描激發出二次電子。放在樣品旁的閃爍體接收這些二次電子，通過放大后調制顯像管的電子束強度，從而改變顯像管熒光屏上的亮度。顯像管的偏轉線圈與樣品表面上的電子束保持同步掃描，這樣顯像管的熒光屏就顯示出樣品表面的形貌圖像，這與工業電視機的工作原理相類似。 掃描式電子顯微鏡的分辨率主要決定于樣品表面上電子束的直徑。放大倍數是顯像管上掃描幅度與樣品上掃描幅度之比，可從幾十倍連續地變化到幾十萬倍。掃描式電子顯微鏡不需要很薄的樣品；圖像有很強的立體感；能利用電子束與物質相互作用而產生的二次電子、吸收電子和 X射線等信息分析物質成分。 掃描式電子顯微鏡的電子槍和聚光鏡與透射式電子顯微鏡的大致相同，但是為了使電子束更細，在聚光鏡下又增加了物鏡和消像散器，在物鏡內部還裝有兩組互相垂直的掃描線圈。物鏡下面的樣品室內裝有可以移動、轉動和傾斜的樣品臺。 透射電子顯微鏡 1932年Ruska發明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM），電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。目前TEM的分辨力可達0.2nm。 透射電子顯微鏡與光學顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同的是前者用電子束作光源，用電磁場作透鏡。另外，由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機（ultramicrotome）制作。電子顯微鏡的放大倍數最高可達近百萬倍、由電子照明系統、電磁透鏡成像系統、真空系統、記錄系統、電源系統等5部分構成。 掃描電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）于20世紀60年代問世，用來觀察標本的表面結構。其工作原理是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關，也就是說與樣品的表面結構有關，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉變為光信號，再經光電倍增管和放大器轉變為電信號來控制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結構。為了使標本表面發射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。 目前掃描電鏡的分辨力為6~10nm，人眼能夠區別熒光屏上兩個相距0.2mm的光點，則掃描電鏡的最大有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。 通俗的說，掃描電鏡是相當與對物體的照相 得到的是表面的，只是表面的，立體三維的圖象。因為掃描的原理是“感知”那些物提被電子束攻擊后發出的次級電子 。而透射電竟就相當于普通顯微鏡，只是用波長更短的電子束替代了會發生衍射的可見光，從而實現了顯微，是二維的圖象。會看到表面的圖象的同時也看到內層物質。就想我們拍的X光片似的，內臟骨骼什么的都重疊著顯現出來，總結就是透射雖然能看見內部但是不立體，掃描立體但是不能看見內部，只局限與表面 。 最后寫論文的時候就用了掃描電鏡的圖，你說看主要做形貌，凡是需要看物質表面形貌的，都可以用掃描電鏡，不過要要注意掃描電鏡目前分辨率，看看能否達到實驗要求。兩種測試手段的適用情況凡是需要看物質表面形貌的，都可以用掃描電鏡，不過最好的掃描電鏡目前分辨率在0.5~1nm左右。如果需要進一步觀察表面形貌，需要使用掃描探針顯微鏡SPM（AFM，STM).如果需要對物質內部晶體或者原子結構進行了解，需要使用TEM. 例如鋼鐵材料的晶格缺陷,細胞內部的組織變化。當然很多時候對于nm 材料的形搜索態也使用TEM觀察。區別掃描電鏡觀察的是樣品表面的形態，而透射電鏡是觀察樣品結構形態的。一般情況下，透射電鏡放大倍數更大，真空要求也更高。掃描電鏡可以看比較“大”的樣品，最大可以達到直徑200mm以上，高度80mm左右，而透射電鏡的樣品只能放在直徑3mm左右的銅網上進行觀察。 一、分析信號 (1)掃描電鏡 掃描電子顯微鏡的制造是依據電子與物質的相互作用。當一束高能的入射電子轟擊物質表面時，被激發的區域將產生二次電子、俄歇電子、特征x射線和連續譜X射線、背散射電子、透射電子，以及在可見、紫外、紅外光區域產生的電磁輻射。同時，也可產生電子-空穴對、晶格振動（聲子）、電子振蕩（等離子體）。原則上講，利用電子和物質的相互作用，可以獲取被測樣品本身的各種物理、化學性質的信息，如形貌、組成、晶體結構、電子結構和內部電場或磁場等等。掃描電子顯微鏡正是根據上述不同信息產生的機理，采用不同的信息檢測器，使選擇檢測得以實現。如對二次電子、背散射電子的采集，可得到有關物質微觀形貌的信息；對X射線的采集，可得到物質化學成分的信息。 (2)透射電鏡 根據德布羅意（De Broglie,20世紀法國科學家）提出的運動的微觀粒子具有波粒二象性的觀點，電子束流也具有波動性，而且電子波的波長比可見光要短得多（例如200千伏加速電壓下電子波波長為0.00251納米），顯然，如果用電子束作光源制成的顯微鏡將具有比光學顯微鏡高得多的分辨能力。更重要的是，由于電子在電場中會受到電場力運動，以及運動的電子在磁場中會受到洛倫茲力的作用而發生偏轉，這使得使用科學手段使電子束聚焦和成像成為可能。 二、結構 (1)掃描電鏡 1．鏡筒 鏡筒包括電子槍、聚光鏡、物鏡及掃描系統。其作用是產生很細的電子束(直徑約幾個nm)，并且使該電子束在樣品表面掃描，同時激發出各種信號。 2．電子信號的收集與處理系統 在樣品室中，掃描電子束與樣品發生相互作用后產生多種信號，其中包括二次電子、背散射電子、X射線、吸收電子、俄歇(Auger)電子等。在上述信號中，最主要的是二次電子，它是被入射電子所激發出來的樣品原子中的外層電子，產生于樣品表面以下幾nm至幾十nm的區域，其產生率主要取決于樣品的形貌和成分。通常所說的掃描電鏡像指的就是二次電子像，它是研究樣品表面形貌的最有用的電子信號。檢測二次電子的檢測器的探頭是一個閃爍體，當電子打到閃爍體上時，就在其中產生光，這種光被光導管傳送到光電倍增管，光信號即被轉變成電流信號，再經前置放大及視頻放大，電流信號轉變成電壓信號，最后被送到顯像管的柵極。 3．電子信號的顯示與記錄系統 掃描電鏡的圖象顯示在陰極射線管(顯像管)上，并由照相機拍照記錄。顯像管有兩個，一個用來觀察，分辨率較低，是長余輝的管子；另一個用來照相記錄，分辨率較高，是短余輝的管子。 4．真空系統及電源系統 掃描電鏡的真空系統由機械泵與油擴散泵組成，其作用是使鏡筒內達到10的真空度。 電源系統供給各部件所需的特定的電源。 (2)透射電鏡 1．電子光學部分 整個電子光學部分完全置于鏡筒之內，自上而下順序排列著電子槍、聚光鏡、樣品室、 物鏡、中間鏡、投影鏡、觀察室、熒光屏、照相機構等裝置。根據這些裝置的功能不同又可將電子光學部分分為照明系統、樣品室、成像系統及圖像觀察和記錄系統。 (1)照明系統 照明系統由電子槍、聚光鏡和相應的平移對中及傾斜調節裝置組成。它的作用是為成像系統提供一束亮度高、相干性好的照明光源。為滿足暗場成像的需要照明電子束可在2-3度范圍內傾斜。 ①電子槍 它由陰極、柵極和陽極構成。在真空中通電加熱后使從陰極發射的電子獲得較高的動能形成定向高速電子流。 ②聚光鏡 聚光鏡的作用是會聚從電子槍發射出來的電子束，控制照明孔徑角、電流密度和光斑尺寸。 (2)樣品室 樣品室中有樣品桿、樣品杯及樣品臺。 (3)成像系統 成像系統一般由物鏡、中間鏡和投影鏡組成。物鏡的分辨本領決定了電鏡的分辨本領，中間鏡和投影鏡的作用是將來自物鏡的圖像進一步放大。 (4)圖像觀察與記錄系統 該系統由熒光屏、照相機、數據顯示等組成。 2．真空系統 真空系統由機械泵、油擴散泵、換向閥門、真空測量儀奉及真空管道組成。它的作用是排除鏡筒內氣體，使鏡筒真空度至少要在 托以上。如果真空度低的話，電子與氣體分子之間的碰撞引起散射而影響襯度，還會使電子柵極與陽極間高壓電離導致極間放電，殘余的氣體還會腐蝕燈絲，污染樣品。 3．供電控制系統 加速電壓和透鏡磁電流不穩定將會產生嚴重的色差及降低電鏡的分辨本領，所以加速電壓和透鏡電流的穩定度是衡量電鏡性能好壞的一個重要標準。 透射電鏡的電路主要由高壓直流電源、透鏡勵磁電源、偏轉器線圈電源、電子槍燈絲加熱電源，以及真空系統控制電路、真空泵電源、照相驅動裝置及自動曝光電路等部分組成。另外，許多高性能的電鏡上還裝備有掃描附件、能譜議、電子能量損失譜等儀器 。 三、功能 (1)掃描電鏡 1、掃描電鏡追求固體物質高分辨的形貌，形態圖像（二次電子探測器SEI)-形貌分析(表面幾何形態，形狀，尺寸） 2、顯示化學成分的空間變化，基于化學成分的相鑒定---化學成分像分布，微區化學成分分析 1)用x射線能譜儀或波譜（EDS or WDS）采集特征X射線信號，生成與樣品形貌相對應的，元素面分布圖或者進行定點化學成分定性定量分析，相鑒定。 2)利用背散射電子(BSE）基于平均原子序數(一般和相對密度相關）反差，生成化學成分相的分布圖像； 3)利用陰極熒光，基于某些痕量元素（如過渡金屬元素，稀土元素等）受電子束激發的光強反差，生成的痕量元素分布圖像。 4)利用樣品電流，基于平均原子序數反差，生成的化學成分相的分布圖像，該圖像與背散射電子圖像亮暗相反。 5)利用俄歇電子，對樣品物質表面1nm表層進行化學元素分布的定性定理分析。 3、在半導體器件（IC)研究中的特殊應用： 1）利用電子束感生電流EBIC進行成像，可以用來進行集成電路中pn結的定位和損傷研究 2）利用樣品電流成像，結果可顯示電路中金屬層的開、短路，因此電阻襯度像經常用來檢查金屬布線層、多晶連線層、金屬到硅的測試圖形和薄膜電阻的導電形式。 3）利用二次電子電位反差像，反映了樣品表面的電位，從它上面可以看出樣品表面各處電位的高低及分布情況，特別是對于器件的隱開路或隱短路部位的確定尤為方便。 4、利用背散射電子衍射信號對樣品物質進行晶體結構（原子在晶體中的排列方式），晶體取向分布分析，基于晶體結構的相鑒定。 (2)透射電鏡 早期的透射電子顯微鏡功能主要是觀察樣品形貌，后來發展到可以通過電子衍射原位分析樣品的晶體結構。具有能將形貌和晶體結構原位觀察的兩個功能是其它結構分析儀器（如光鏡和X射線衍射儀）所不具備的。 透射電子顯微鏡增加附件后，其功能可以從原來的樣品內部組織形貌觀察（TEM）、原位的電子衍射分析（Diff），發展到還可以進行原位的成分分析（能譜儀EDS、特征能量損失譜EELS）、表面形貌觀察（二次電子像SED、背散射電子像BED）和透射掃描像（STEM）。 結合樣品臺設計成高溫臺、低溫臺和拉伸臺，透射電子顯微鏡還可以在加熱狀態、低溫冷卻狀態和拉伸狀態下觀察樣品動態的組織結構、成分的變化，使得透射電子顯微鏡的功能進一步的拓寬。 透射電子顯微鏡功能的拓寬意味著一臺儀器在不更換樣品的情況下可以進行多種分析，尤其是可以針對同一微區位置進行形貌、晶體結構、成分（價態）的全面分析。 四、襯度原理 (1)掃描電鏡 1、質厚襯度 質厚襯度是非晶體樣品襯度的主要來源。樣品不同微區存在原子序數和厚度的差異形成的。來源于電子的非相干散射，Z越高，產生散射的比例越大；d增加，將發生更多的散射。不同微區Z和d的差異，使進入物鏡光闌并聚焦于像平面的散射電子I有差別，形成像的襯度。Z較高、樣品較厚區域在屏上顯示為較暗區域。圖像上的襯度變化反映了樣品相應區域的原子序數和厚度的變化。質厚襯度受物鏡光闌孔徑和加速V的影響。選擇大孔徑（較多散射電子參與成像），圖像亮度增加，散射與非散射區域間的襯度降低。選擇低電壓（較多電子散射到光闌孔徑外），襯度提高，亮度降低。支持膜法和萃取復型，質厚襯度圖像比較直觀。 2、衍射襯度 衍射襯度是來源于晶體試樣各部分滿足布拉格反射條件不同和結構振幅的差異。例如電壓一定時，入射束強度是一定的，假為L，衍射束強度為ID。在忽略吸收的情況下，透射束為L-ID。這樣如果只讓透射束通過物鏡光闌成像，那么就會由于樣品中各晶面或強衍射或弱衍射或不衍射，導致透射束相應強度的變化，從而在熒光屏上形成襯度。形成襯度的過程中，起決定作用的是晶體對電子束的衍射。 (2)透射電鏡 晶體結構可以通過高分辨率透射電子顯微鏡來研究，這種技術也被稱為相襯顯微技術。當使用場發射電子源的時候，觀測圖像通過由電子與樣品相互作用導致的電子波相位的差別重構得出。然而由于圖像還依賴于射在屏幕上的電子的數量，對相襯圖像的識別更加復雜。 非晶樣品透射電子顯微圖象襯度是由于樣品不同微區間存在的原子序數或厚度的差異而形成的，即質量厚度襯度（質量厚度定義為試樣下表面單位面積以上柱體中的質量），也叫質厚襯度。質厚襯度適用于對復型膜試樣電子圖象作出解釋。質量厚度數值較大的，對電子的吸收散射作用強，使電子散射到光欄以外的要多，對應較安的襯度。質量厚度數值小的，對應較亮的襯度。 五、對樣品要求 (1)掃描電鏡 SEM制樣對樣品的厚度沒有特殊要求，可以采用切、磨、拋光或解理等方法將特定剖面呈現出來，從而轉化為可以觀察的表面。這樣的表面如果直接觀察，看到的只有表面加工損傷，一般要利用不同的化學溶液進行擇優腐蝕，才能產生有利于觀察的襯度。不過腐蝕會使樣品失去原結構的部分真實情況，同時引入部分人為的干擾，對樣品中厚度極小的薄層來說，造成的誤差更大。 (2)透射電鏡 由于TEM得到的顯微圖像的質量強烈依賴于樣品的厚度，因此樣品觀測部位要非常的薄，例如存儲器器件的TEM樣品一般只能有10～100nm的厚度，這給TEM制樣帶來很大的難度。初學者在制樣過程中用手工或者機械控制磨制的成品率不高，一旦過度削磨則使該樣品報廢。TEM制樣的另一個問題是觀測點的定位，一般的制樣只能獲得10mm量級的薄的觀測范圍，這在需要精確定位分析的時候，目標往往落在觀測范圍之外。目前比較理想的解決方法是通過聚焦離子束刻蝕（FIB）來進行精細加工。 電鏡觀察的是樣品的亞顯微結構,在制備樣品的過程的主要目的就是維持細胞的細微結構, 透射電鏡的樣品要制備超薄切片包括:固定-脫水-浸透-包埋-切片等過程 掃描電鏡相對簡單:原則上只要經過固定-二氧化碳干燥-鍍金就可以觀察 先以透射電鏡為例,結合我自己的體會詳細介紹一下: 1樣品緩沖液: 由于細胞本身的緩沖能力很小，在非緩沖的固定液中固定時，細胞會因逐漸酸化而產生損傷。為了防止這種損傷，一般都采用具有緩沖能力的固定液對組織進行固定。由于固定不同的組織對固定液所要求的PH值和滲透壓不同，因此，根據不同組織的要求，可通過緩沖液調整固定液的PH值和滲透壓．常用的緩沖液有磷酸緩沖液，醋酸一巴比妥緩沖液和二甲胂酸鈉緩沖液． 2 樣品的固定: 用化學固定劑或冰凍、干燥及高溫等物理方法迅速殺死細胞過程叫固定．電鏡生物樣品的化學固定是化學固定劑與細胞成分，即蛋白質和脂類形成交聯來保存細胞結構，把可動的動態系統轉變成不可動的、穩定的膠體，并且這種膠體要在所有方面近可能地接近生活有機體的狀態，而不會由于一系列的后繼處理發生移位或丟失內部的結構物質。 現在采用戊二醛與鋨酸雙重固定祛對生物材料進行固定的居多。因為醛類被認為能夠與蛋白質形成交聯,而戊二醛被認為是能夠保存細微結構最好的醛類.鋨酸是唯一能夠固定脂類的固定劑.(鋨酸劇毒,能夠讓人永久喪失嗅覺,配制的時候一定小心) 采用雙重固定法使戊二醛與鋨酸這兩種固定劑相互取長補短，更好地發揮固定作用. 3 樣品脫水: 固定后的組織要經過包埋劑的包埋、聚合形成能夠進行超薄切片的硬塊。由于包埋劑不溶于水，只有將細胞中的游離水徹底清除之后，非水溶性的包埋劑才能滲入細胞。因此固定后的樣品必須進行徹底脫水。常用脫水劑有乙醇和丙酮。脫水劑的特點是即能和水相溶又能和包埋劑相溶。在脫水過程中，逐漸提高脫水劑的濃度可將細胞內的水分取代. 脫水時候要主意梯度的提高一定要緩慢,猛烈的梯度變化會嚴重影響細胞結構. 包埋劑建議選用Epon812樹脂的包埋配方,應為這種樹脂被認為在凝聚的時候發生的形變是最小的.Epon812 溶于丙酮,所以一般在脫水到80%乙醇的時候換為丙酮梯度繼續脫水. 4:浸透包埋劑(這一步與包埋是連在一起進行的): 浸透是用包埋劑將組織內的脫水劑取代，包埋劑浸入細胞中，使細胞內外所有空間都被包埋劑充填。包埋劑為一種環氧樹脂，其分子內有兩種反應基團，即環氧基和羥基。環氧基位于分子末端，與一種叫催化劑的胺類化合物反應，環氧基打開，形成首尾相聯的長鏈化合物。分子中的羥基與酸酐結合形成分子間的交聯橋。因此，當樹脂、胺類及酸酐三者混合并加溫后，樹脂分子發生三維聚合使包埋劑由單體聚合成高分子，并使樣品包埋其中，形成具有一定硬度和韌性的包埋塊，保存了細胞內的精細結構，有利于超薄切片的操作. 這一步主要注意在配制包埋劑的時候要保持干燥,盡可能選天氣濕度小的時候配制,包埋劑中一定不能混入氣泡,配制完畢套上紙袋放入干燥器中備用.所用器皿應烘干，不能有任何水分； 配藥時每加入一樣藥品都要攪拌均勻； 5:切片 電鏡的透射電子穿透能力很弱，因此大多數標本不能直接在電鏡下觀察。電鏡的分辨能力不僅取決于顯微鏡本身，更主要是切片的厚度；要獲得高質量的電鏡照片，固定和包埋的樣品必須用超薄切片機切成大約50一70nm厚的超薄切片。超薄切片要經過染色才能在電鏡下顯示清晰的結構。染色的目的是增強樣品中各種結構之間的圖像反差或選擇性顯示某些結構成分。生物樣品超薄切片的染色為“電子染色”，即用重金屬化合物與細胞結構物質結合，增加細胞結構物質的電子密度，以此增強對電子的散射能力，使圖像呈現出明顯的黑白對比。生物樣品超薄切片的染色可分為常規的細胞學染色和細胞化學染色。常規細胞學染色，即醋酸雙氧鈾一檸檬酸鉛雙重染色法。醋酸雙氧鈾主要使細胞核及結締組織染色，檸檬酸鉛主要提高細胞質成分的反差。 主要注意的是超薄切片機的操作:玻璃刀的制作；玻璃刀上水面的調節；以及銅網撈片.這些步驟最好能有經驗豐富的試驗員指導,否則超薄切片機易于損壞,操作也不易成功. 6:樣品支撐膜的制作: 用光學顯微鏡觀察各種生物材料時是將標本放在玻璃片上。在電子顯微鏡下，電子不能穿透玻璃，所以不能用玻璃片作為標卒的支持物。于是采用一種很薄的、電子可穿透的薄膜附著在金屬網上做支持物。金屬載網大多數是用銅制成的，所以也稱銅網。根據不同需要，載網的網孔可制成大小不同的孔徑，可分為100目、200目。支持膜可分有機膜和碳膜兩種。有機膜又根據制膜材料可分聚乙烯醇縮甲醛膜(Formvar膜)和火棉膠(硝基纖維素)膜。 (1)操作的關鍵是玻璃片一定要干凈、光潔，否則膜不能從玻璃上剝落漂起； (2)溶劑不能有水分和雜質，否則膜上會有許多斑點； (3)漂浮膜時動作要輕巧，手不能發抖，否則膜將發皺： (4)操作過程中要避風防塵 制好的支撐膜覆蓋到銅網上,用很精密的鑷子夾取銅網在玻璃刀的刀口附近的水面上撈取切片. 經過了這些步驟,切片基本就可以上透射電鏡觀察了. 掃描電子顯微鏡樣品制備: 掃描電鏡是依靠樣品表面放出的二次電子量的不同來形成圖象反差的，因此掃描電鏡非常適合于觀察樣品的表面結構。由于生物樣品含有大量的水分，樣品進行觀察時是在高真空內進行的，這樣，生物樣品在真空的作用下易失水而使細胞破壞，從而影響觀察。因此，為了保證細胞結構的完整，必須在觀察前將樣品進行固定、脫水和干燥。又由于干燥后的樣品表面電阻大，易積累電荷引起放電，從而影響圖象質量。這樣，干燥后的生物樣品還要進行導電處理。 固定和脫水與透射電鏡相同,脫水到100%乙醇或丙酮的時候,樣品轉入CO2臨界點干燥儀,將樣品干燥,干燥后的樣片用兩面膠貼到樣品臺上,放入離子濺射儀鍍金,然后就可以觀察了.
