實驗室里經常聽到這樣的抱怨：實驗沒做好，實驗沒結果，心情郁悶。但其實靜下心來查找原因，往往是由于操作上面的不認真，或是一些小小的細節沒有注意到，以下是10個實驗室日常小技巧。
主題：
關于質粒提取的小技巧
內容：
現在用質粒提取試劑盒非常方便，而且菌體培養后，可以多管濃縮提取，提到的質粒量多，可以-20℃保存，以后用于酶切、轉化等實驗，可以提前跑個膠，只要不降解，就可以繼續用，避免每次要用，都要培養一遍再提取一遍。
1.質粒DNA提取
提取質粒的時候，最后一步的酒精揮發很關鍵，基本上是其后續的酶切反應的決定性因素。所以這一步盡量揮發長一點時間，最好是空調吹熱風，或是37度溫箱放長一點的時間，我試過室溫過夜，酶切很好。
將amp濃度提高到200μg/mL，下班前接種，次日一早收獲菌體，此時OD雖然不高，質粒豐度卻不一般。菌體量少些，操作體積(管數)也小(少)。
手提質粒，如果用氛氯仿和氯仿兩步抽提，再注意一下手法，嚴格按照參考書上面的操作的話，提出的質粒不比任何質粒提取試劑盒差，我感覺好像還好一點，我就用過一次試劑盒，比較了之后不如我手提的好，以后再也沒用過了。
2. Western Blot
做western blot的時候，大家往往會摸索一抗、二抗的濃度，封閉時間，曝光時間等，而每次變換其中的一個條件就需要從新跑膠、轉膜，甚至重新提蛋白，這樣會浪費大量的時間。其實完全沒有必要這樣。一次轉膜后，將PVDF膜晾干，裁減成小塊，保存起來，用的時候取出一塊，沒有任何影響。這對于摸索條件的戰友來說，節約了大量的時間。
做western blot轉膜時，膠放在轉膜緩沖液中一段時間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝 好轉膜裝置，我的經驗是把膜印在膠上直接在膜上畫出預染maker條帶，方便的很。因為很多時候跑電泳時膠上的預染maker很清楚，等轉膜后就不是分辨的很清楚了。不過要注意畫好預染maker后就不要使膠和膜發生對位移動了，以防maker失去參照價值。
器具的清潔非常重要，開始做前，為了安全，尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來水反復沖洗，確保無洗滌殘液后用蒸餾水沖洗2～3遍，然后用去離子水沖洗一遍。最后用95%酒精再擦一遍后晾干備用。
配膠最好現用現配，先配下層膠(分離膠)，后配上層膠(濃縮膠或積層膠)，而且在臨灌膠前加APS并迅速混勻，即用移液槍抽吸與注入1～2次即可。
3. 緩沖液和培養基配置
(1)將緩沖液配方中的成分分別以10～100倍配成母液儲存，需要的時候只需將相應的母液混合，補加水稀釋即可;
(2)配培養基時通常會忘記各成分的量，如，配LB時的三個成分不記得到底哪個是5 g，哪個要10個，因此可以在常用的試劑瓶的標簽上注明所需的量，如，配LB時，在NaCl瓶外注明10g/L，yeast5g/L，tryton10g/L等，很方便，不需要每次配之前臨時翻書。
4. PCR
在做克隆鑒定的時候經常需要在酶切鑒定前進行PCR鑒定，每次配置PCR反應液很繁瑣，可以將其配置類似kit的形式，按你需要的反應體系列表，然后放大100倍配置100×主反應液(100次反應)，其中含buffer，Mg2+，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10×分裝或一管儲存在-20度，在需要的時候拿出融開，然后按所需的PCR反應個數吸取相應的倍數，再補加相應反應倍數的Taq和引物，混勻后分裝，這樣做的好處如下：
(1)可極大的節省寶貴的時間，可早點收工，看球;
(2)避免每次反應加樣不均的可能;
(3)大大減少PCR假陽性的產生。
5. 酶切
如果是要做酶切，提質粒的最后一步最好是用水溶解DNA，因為，TE里面的離子會影響酶切的效率。雙酶切制備克隆插入片段的載體，最好選擇帶有外源片段的質粒，是否酶切完全，從電泳條帶的分子量上可以比較明確地判斷。空質粒單切完全和雙切完全在分子量上差異不大。在做酶切時，也可以象PCR一樣配置主反應液，每次反應前先列好反應的體系，算好需要的反應數，然后按所需反應的體系按所需反應數放大，加入buffer、酶、水，質粒欄空缺，然后混合后按除質粒DNA的體積分裝，然后，再在每管中加入相應體積的質粒DNA酶切，這樣做的好處如下，特別是當同時有10幾個陽性克隆需要鑒定時尤為明顯：
(1)各反應成分均一;
(2)可大大減少限制型內切酶的使用;
(3)節省時間。
6.大腸桿菌轉化實驗
有時候第一天涂的轉化平板、次日早晨轉化子可能長成的菌落比較大(1~2毫米以上，BL21就長得快)，下一步轉化子做質粒鑒定。這個情況下可以直接挑取一塊菌苔(勿帶出培養基)，50微升酚/氯仿懸浮菌體，放置兩分鐘，加40微升TE抽提，上層TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上層TE即是質粒提取液。提取的質粒可以直接用于電泳和酶切。這樣操作，可以省去轉接液體試管的培養步驟，至少節省6~8小時的時間。但是，要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和酶切的效果，不同的實驗室或者操作者未必能夠很方便地重復。
轉化時一定要做一個宿主菌的對照，即，重組質粒涂板后再用宿主菌涂響應抗性的平板，以確定第二天長出來的克隆是否正確，我當時做了三次轉化之后才發現不成功竟然是由于BL21可以在Amp(+)的平板上面生長。
7.蛋白質的表達、分離、純化
當蛋白大量的表達時，包含體的形成幾乎是不可避免的，而且很難通過改變一些誘導條件來改變，最有效的辦法就是換表達系統，所以如果時間還充分的話，可以嘗試一下，如果時間較短了，還是安心的座包含體蛋白的處理算了，而且變性之后的蛋白通過一些方法復性率也可以達到60%以上。
8. PCR擴增產物的克隆
引物設計主要是要注意以下幾個事項：
(1)發夾結構;
(2)反向配對;
(3)GC含量(40～60%);
(4)退火溫度(45～65度);
(5)引物長度(18～27bp);
(6)3'端最好是C、G(提高結合度);
(7)引物在序列中的錯配位點;
※大致就這幾個方面，重要性依次降低，由其是3'端絕對不能形成發夾結構。
那么你說你這段能不能設計引物呢?其實設計引物都只是好中選優的問題。
9.細胞凍存和復蘇實驗
(1)可以提前把需要的體積的培養液放到培養瓶里，擰松瓶蓋，放到孵箱里半小時到1小時，這樣溫度和pH值都已經最適合細胞生長了。
(2)為防止凍存管在升溫時爆裂等，可以在放入水浴前就實現在超凈臺里把蓋子擰松一下然后再擰上。從液氮罐里拿出來不是說一定要分秒必爭地放入水浴。細胞從液氮的零下1百多度升到比如負八十這個過程對細胞沒有損害。有足夠的時間handle這些。只不過一旦細胞化了，就應該爭分奪秒地把它放入培養液了，主要是為了：稀釋DMSO。常溫下高濃度DMSO對細胞的損害比較大。
(3)水浴溫度40℃應該也沒問題，但正規的protocol上從來都只說37℃。反正應該相差不大，但不能太高了。另外，不必等細胞全化了再從水浴里取出來。只要冰塊浮起來了就差不多了。我一般最多水浴不超過1.5分鐘。然后經過噴酒精消毒什么的差不多又半分鐘過去了。每次都還有沒化的。先把已經融解的部分吸到培養瓶里，再從培養瓶里吸些培養液到凍存管里，余下的冰塊瞬間就化了，再一起吸到培養瓶里。
10.逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)
(1)RT-PCR有兩種做法
條件具備的話可用kit進行一步法進行;若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但后來發現兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現象，我推測是體系更加單一比較利于PCR的進行，當然也可能是我買的kit不太好。(promega)。
(2)RT-PCR應具備的條件
高質量的RNA(保留后可做5‘，3’RACE);引物的(最好產物短點);若涉及粗略定量的話還應考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度(如果由內標分子更好，但我發現其實很不容易將RNA的濃度以及內標分子的表達量調整的完全一樣);體系的均一性等。
(3)RACE
我做過RACE(3’RACE是寶生物的Kit;5’RACE是Gibico)，但現在再進行另一個同源基因的3‘RACE時卻怎么也P不出來，這兩個基因是由同一對引物擴增出來的，其中一個已經獲得了全序列(RACE的方法)，而另一個基因的3‘UTR卻怎么也擴不出來，我推測是不是該基因的3‘UTR太長的緣故。
附：移液器操作六部曲，別再犯這些小錯誤!
移液槍是實驗操作上不可缺少的工具，對于頂尖高手而言，重要的就是實驗的誤差最小，重復再現性好，那就要注意正確移液槍使用，避免因小失大。
一.移液六部曲
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1.裝吸頭
移液器套柄用力下壓，需要時小幅度旋轉即可。
錯誤操作：
用力敲擊吸頭。此方法會帶來吸頭損壞甚至移液器套柄磨損，從而影響其密封性。
2.量程設定
操作之前請先選擇正確的移液器，移液器可在10～100%量程范圍內操作，但在10%量程處操作對于移液技巧要求高，故推薦在35～100%量程范圍內操作。
量程調節：
當由小量程調節至大量程時，朝所需量程方向連貫旋轉，旋轉到達超過所需量程1/3圈處再回調至所需量程。當由大量程調節至小量程時，直接連貫旋轉至所需量程。
3.潤洗
用同一樣品重復吸液排液二至三次，潤洗為以后每次吸液提供相同的接觸面，保證操作的一致性。
注意：高溫或者低溫液體請不要潤洗!
4.吸頭浸入角度
吸液時盡量保持垂直狀態，傾斜角度不能超過20°
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5.吸頭浸入深度
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6.吸頭浸入時間
吸液后在液面中保持一秒鐘再將吸頭平緩移開，這對于大容量移液器或者吸取粘性樣品尤為重要。
7.吸液速度
勻速連貫移液，控制好移液速度，太快會造成噴液，液體或者氣霧沖入移液器內部，污染活塞等部件。
8.排液及吹液
先將活塞按至第一檔排液，略作停頓后按至第二檔進行吹液。
排液四種方式：
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9.手溫
移液器不宜長時間握在手里，不用時最好將其掛在支架上或者掛在手上晾一下。
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二.移液槍使用訣竅
1.影響移液槍精度因素
(1)溫度：
室溫低時，手溫較高，使得空氣膨脹，吸入冷溶液時往往發生誤差;
(2)氣密性：
tip和槍體的結合部，以及槍內柱體之間的長期磨損，造成誤差;
(3)吸速：
容易造成tip內氣泡產生，而且會污染槍頭;
(4)試劑的揮發：
吸揮發性高的試劑時，蒸汽進入槍頭，內壓增高，結果在壓出液體時，壓力變大，而產生誤差;
解決辦法：
反復抽吸4～5次就可改善。
2.使用注意事項
(1)吸取液體時一定要緩慢平穩地松開拇指，絕不允許突然松開，以防將溶液吸入過快而沖入取液器內腐蝕柱塞而造成漏氣;
(2)為獲得較高的精度，吸頭需預先吸取一次樣品溶液，然后再正式移液，因為，吸取血清蛋白質溶液或有機溶劑時，吸頭內壁會殘留一層“液膜”，造成排液量偏小而產生誤差;
(3)濃度和粘度大的液體，會產生誤差，為消除其誤差的補償量，可由試驗確定，補償量可用調節旋鈕改變讀數窗的讀數來進行設定;
(4)可用分析天平稱量所取純水的重量并進行計算的方法，來校正取液器，1mL蒸餾水20℃時重0.9982g;
(5)移液器反復撞擊吸頭來上緊的方法是非常不可取的，長期操作會使內部零件松散而損壞移液器;
(6)移液器未裝吸頭時，切莫移液;
(7)在設置量程時，請注意，旋轉到所需量程，數字清楚顯示在窗中，所設量程在移液器量程范圍內不要將按鈕旋出量程，否則，會卡住機械裝置，損壞移液器。
(8)移液器嚴禁吸取有強揮發性、強腐蝕性的液體(如，濃酸、濃堿、有機物等)。
(9)嚴禁使用移液器吹打混勻液體。
(10)不要用大量程的移液器移取小體積的液體，以免影響準確度。同時，如果需要移取量程范圍以外較大量的液體，請使用移液管進行操作。
三.移液器錯誤操作及處理方法
做為液體操作中最常用的手動可調精密移液器，在使用過程中有些錯誤的操作會給操作本身帶來誤差，有些會造成機器的損壞等，在這里簡單總結如下：
錯誤：裝配吸頭時用移液器反復撞擊吸頭，以上緊;
正確：插入吸頭，左右輕轉旋轉上緊吸頭;
分析：撞擊會造成移液器內部齒輪組合的松動，長期操作會對移液器的精確性造成影響;
錯誤：吸頭與移液器不匹配，影響氣密性;正確選用與移液器匹配、有質量保證的吸頭;
分析：吸頭的不匹配，主要表現為對氣密性的影響。會直接影響移液器的精確性，通常會移液操作會小于設定量;
錯誤：吸液時，移液器傾斜吸液;
正確：垂直吸液;
分析：傾斜的狀態會造成氣壓面的改變。會對移液精度造成影響;
錯誤：吸頭內含有未打出的液體時，移液器平置于桌面;
正確：將移液器垂直掛在移液器支架上;
分析：吸頭內含有未打出液體，移液器平放之后液體有可能會流到移液器體內部，這會對移液器內部組件造成影響，嚴重的回造成損壞，較差污染等情況的發生;
錯誤：用大量程的移液器移取小體積的液體;
正確：移液體積需保證在移液器所提供的量程范圍之內才符合不準確度和不精確度的要求;
分析：因為空氣墊的存在，是造成移液器不準確度的主要原因。移液器的選擇應該是最大量程，最接近目的液體轉移量的選型原則;
錯誤：吸取具有強揮發性的液體;
正確：不建議用普通移液器做強揮發型液體轉移;
分析：如果一定要移取強揮發性的液體，應該在移液結束后立刻拆開移液器，讓蒸汽揮發，同時，建議使用外置活塞式移液器;
錯誤：吸液速度和放液速度過快;
正確：慢吸慢放;
分析：快吸對于1mL及以上量程的移液器，很容易造成液體上沖，過快的放液會增加液體的殘留量。
