關于淘汰β脂蛋白測定
淘汰血清β脂蛋白測定的理由及替代項目
淘 汰 的 理 由
血清脂蛋白測定始于50年代，最早用紙電泳分析。當時的技術只能將脂蛋白分為α與β兩條區帶，不能將β與前β區帶分開，而且也只能測α與β脂蛋白的相對含量。隨著硫酸多糖類化合物(如肝素、硫酸葡聚糖)在分離制備脂蛋白研究中取得成功，1960年前后開始沿用這一原理設計出血清β脂蛋白(繼續應用電泳法中的名稱)簡易比濁測定法。30年來國內通用肝素與β脂蛋白形成復合物，加入兩價金屬離子(Mn2+或Ca2+)產生混濁沉淀的方法，結果以沉淀物中脂質含量來表示，故又稱β脂質測定。此法遠比電泳法簡單快速，適于分析成批標本，但仍不能區分β與前β脂蛋白。
此法的主要缺點有二：
1．濁度高低代表β與“前β”脂蛋白的總和(現在多稱低密度與極低密度脂蛋白，LDL與VLDL)。LDL的組成主要是膽固醇，而VLDL的組成主要是甘油三酯(TG)。臨床上需要知道血清總膽固醇(TC)與TG水平，而β脂蛋白試驗不能滿足這項要求。當時因直接測定TG尚無簡單的方法，所以同時測定TC與β脂蛋白可以大致估計TG是否增高，但這畢竟相當粗糙。當前在心血管病危險因素估計中要求分別測定高密度脂蛋白(HDL)與LDL中的膽固醇(HDL—c與LDL—c)，更非β脂蛋白試驗所能表達。
2．在測定方法上，因為LDL與VLDL脂質的相對含量以及它們各自的脂質組成均為可變，等量LDL與VLDL所產生的濁度也不一致，所以對β脂質的測定難于制定合適的標準品。各實驗室自行制備標準物繪制標準曲線，測出結果沒有可比性，根本談不上“標準化”。有的實驗室用硫酸鋇人工濁度標準，當然也不可行。所以這項試驗的濁度高低只是血脂高低的初步過篩試驗而已。
可 替 代 的 試 驗
近20年來脂蛋白生化、代謝與臨床研究日益深入，測定計數發展迅速。對高脂蛋白癥(包括高膽固醇血癥及高甘油三脂血癥)及特殊的脂蛋白異常情況的診斷，可以按照以下的程序進行檢查。
1.血清(漿)外觀檢查
不要忽視這項肉眼觀察所能提供的信息。血清混濁通常表示TG升高，將混濁血清裝在小試管中，放置4℃冰箱過夜，如血清上浮奶油樣層而下部變清者，產示有乳糜微粒(CM)增加(故又稱CM試驗)，如不分層而保持原先的混濁者表示為VLDL增多，有奶油樣頂層而下部依舊混濁者表示CM與VLDL都增多。高膽固醇血癥而無高TG者血清不出現混濁。
2．TC測定
這是脂類分析中最常用的試驗。TC高低通常反映LDL-C的高低，但也在一定程度上受HDL-C水平的影響。
3．TG測定
是高甘油三酯血癥的診斷指標。除了餐后外，空腹血中出現CM是少見的，所以空腹血中TG升高代表VLDL增多。
4．HDL-C測定
HDL有促進膽固醇逆向轉運的功能，可能有拮抗動脈壁脂質沉積的作用。HDL-C降低是心、腦血管病的危險因素之一，目前大醫院中已將HDL-C測定作為常規檢驗，也用於流行病學調查。
5．LDL-C測定
國內多用Friedlewald公式計算LDL-C數值，此公式為，
LDL-C＝TC—HDL—C—BLDL-C
原式采用舊單位(mg／d”，BLDL-C以TG／5代入，意即VLDL—C與血清TG之比為1：5。在病理狀態下，此比例有較大變動，一般認為TG高于400mg／d1時計算結果不準確。此外只有TC、TG、HDL-C三項測定都準確可靠，才能計算得 LDL-C的近似值。現在已經有LDL-C直接測定方法，并有試劑盒提供，但在TG過高時，對測定結果也有一定影響。
衛生部1991年第18號文件中指定的β脂蛋白后的可替代項目即上述2、3、4三項。臨床及實驗室工作者應該知道β脂蛋白測定只是過去受技術條件限制所采用的半定量實驗，不能具體反映TC、TG及脂羞白譜的變動情況，基層醫療單位也應該創造條件采用新技術，淘汰過時的技術，以提高防治工作水平。
血清總膽固醇測定方法
血清膽固醇(CHOL)測定方法種類繁多，化學方法大都用有機溶劑提取血清中的CHOL，用特殊試劑顯色，然后比色測定。主要顯色反應有Liebermann—Burchard(L-B)反應及高鐵—硫酸反應等兩類。這些方法須用腐蝕性的濃酸試劑，特異性差，干擾因素多，準確測定有賴于從血清中提取膽固醇，并對抽提液進行純化。因此操作步驟多，不適于常規應用。美國疾病控制中心(CDC)脂類測定標準化實驗室所審定的ALBK法，由于抽提液中基本上不存在L-B反應的干擾物，結果準確，為目前國際上通用的參考方法。此法雖然不很復雜，但也不易準確掌握。現在還有少數實驗室應用L—B試劑直接顯色法、鄰苯二甲醛法等，準確性差，已在淘汰之列。
在常規工作中現在已普遍應用酶法。此法特異，靈敏，精密，用單一試劑直接測定，既便于手工操作，也適用於。自動分析儀測大批標本；既可作終點法，也可作速率法測定。酶法都采用膽固醇酯酶(CEH)水解膽固醇酯(cE)，同時以膽固醇氧化酶(CHOD)將膽固醇氧化成膽甾烯酮并產生H202終點物的測定則有幾種不同的方法。目前普遍應用依賴于H202的顯色系統，即Trinder指示反應，試劑包括過氧化物酶(POD)、4—氨基安替比林(4—AAP)和酚(三者簡稱PAP)。
總膽固醇(TC)鍘定要求做到標準化，與國際標準取得統一。化學測定的膽固醇標準液應以美國NIST(原NBS)的SRM911b為準，其純度為99.8±0.1％。國內應制出相應的膽固醇純品。酶法中常用定值血清作標準，規定用參考方法(ALBK法)定值，定值時須用相當于SRM91Jb的膽固醇純品配制標準溶液。
以下介紹通用的酶法(CHOD-PAP法)。
原理
血清中的CE用CEH水解，游離膽固醇被CHOD氧化，所產生的H202用Trinder反應顯色：
CEH
CE+H2O--------→膽固醇+脂肪酸
CHOD
膽固醇+O2--------→△4△甾烯酮+H2O2
POD
2H2O2+4AAP+酚--------→醌亞胺染料+4H2O
紅色醌亞胺的最大吸收在波長500nm，吸光度(A)與血清TC量成正比。
(二)試劑
1．酶試劑
組成因不同商品而異，為干粉或凍干品。成分舉例如下。
磷酸鹽緩沖液，pH7.7 0.3mol／L
CEH(假單胞菌) ≥800u／I
CHOD(諾卡氏菌) ≥400u／L
辣根POD ≥5000u／L
膽酸鈉 3mmol／L
4—AAP 0.5mmoi／l
酚 3.5mmol／L
表面活性劑(TritonX—100)與穩定劑適量? 此試劑在4℃至少穩定半年。復溶后在4℃穩定二周。
2．參考標準
以ALBK法定值的混合血清，TC濃度在5．2mmol／L(200mg／d1)左右。凍干品可在4℃存放一年，臨用前以水復溶。
(三)測定操作
標本為及時分離的空腹血清：肝素或EDTA抗凝血漿，放置室溫中應于當天測定，存放4℃冰箱中可在5天內測定。
終點法：標本管與標準管中分別加入標本與定值血清各10ul，酶試劑1.00ml，混勻后在37℃放置5分鐘，或20—25℃、10分鐘后用光度計比色，以酶試劑為空白，波長500nm，呈色穩定至少1小時。
計算： 標本管A
血清TC(mmol／L)＝---------------×定值血清TC(mmol／L)
標本管B
本法線性范圍：0—13mmol／L(0—500mg／L)
參考值：
人群TC水平因生活條件而異，隨年齡增長而上升。中青年男子略高於女子，老年女子高于男子。中、老年人合適水平為<5.2mmol／L(<200mg／dl)，5.2—6.5mmol／L(200—250mg／d1)為臨界值(或輕度偏高)，>6.5mmol／L(>250mg／d1)為高膽固醇血癥(危險水平)，>7．8mmol／L(>300mg／d1)可視為嚴重的高膽固醇血癥。
(四)附注
1．試劑甲兩種酶(CEH和CHOD)的質量十分重要。CEH必須能有效地水解各種脂肪酸(包括花生四烯酸)的膽固醇酯，CHOD氧化膽固醇完全。選用試劑盒時可以測試對血清標本膽固醇的反應速度。好的試劑一般能在5分鐘(有的只要1—2分鐘)內；反應達到終點，反應不能在10分鐘內完成的試劑不宜采用。其原因可能是原酶質量不好，或酶用量太少。后者可便TC高濃度時的測定值偏低。按本文所述試劑配方，血清標本與酶試劑用量的適當比例為1：100，此時測定范圍上界達13mmol／L(500mg／dl)。過高地提高血清比例，會使測定上限降低。如果標本中TC濃度超過13 mmol／L，可用生理鹽水稀釋后重新測定
2．指示反應選擇最常用的Trinder法，主要優點是所生成的紅色復合物在低POD活力下也能形成，溶解度高，對自氧化不敏感，線性范圍寬，顏色穩定。此反應中可以用酚或苯胺的衍生物代替酚·；也可以用高靈敏度的2羥—3．5二氯苯磺酸：2、4、6三溴一3羥苯甲酸等為色原。但在臨床應用中只要能兼顧TC與HDL-C測定，靈敏度適當的試劑即可。
3．血清中的膽固醇與純膽固醇溶液(醇溶液或有助溶劑的水溶液)在酶作用下的反應速度不一致，原因不僅在于前者CE占70％，而后者為游離膽田醇，而且還有作用時的基質不同，不同酶制品對CE的水解程度不同，血清中干擾物的存在等因素。所以現在多主張用定值血清為參考標準。如果采用準確定值的血清，用任何合格的商品試劑都可測出基本一致的結果。為了使TC測定符合國際標準化，定值血清的準確性最好與CDC參考血清核對。
4．干擾因素
血清維生素c 30mg／L、膽紅素0.1g/L時對Trimder反應不會有明顯干擾，過高可使結果偏低。血紅蛋白可能引起正干擾。血清中其他固醇類物質含量甚微，不引起明顯干擾
5．本法精密度好，在儀器穩定及操作熟練的情況下，批內CV<1％，批間CV<2％。