三十五項淘汰臨床檢驗項目、方法及替代實驗(23)

關予淘汰血紅蛋白血液硫酸銅比重試驗和血紅蛋白沙利氏目測法

淘汰血紅蛋白血液硫酸銅比重試驗、沙利氏目測法的原因及替代方法

　　血紅蛋白(Hb)是紅細胞的主要成份，具有與氧分子呈可逆性結合的功能，是人體內氧的運輸和交換的主要載體。許多疾病的病理生理變化都涉及Hb質或量的改變。因此，選擇一種簡便、快速、準確的Hb測定法，對于貧血及其他造血系統疾病的診斷和治療有著重要的意義。

　　自1875年Gower設計稀釋溶血液目視比色法以來，血液學工作者對Hb測定進行的大量探討，大致可分為四大類，即：（1）根據血液物理特性測Hb(比重法)：(2)根據Hb分子組成而設計的總Hb測定法(全血鐵法)；(3)根據Hb有O2可逆性結合的特性測Hb(血氣分析法)，和(4)根據Hb衍生物光譜特點進行的定量法。其中有些方法雖簡單易行，但誤差較大，隨著技術的進步和研究的深入，逐漸被淘汰。惟其如此，此次衛生部令決定在國內淘汰硫酸銅比重血紅蛋白測定法和沙利氏(Sahli)比色Hb測定法，并推薦氰化高鐵法做為可替代的方法。

淘　汰　的　理　由

一、為什么淘汰血紅蛋白硫酸銅比重測定法

　　硫酸銅比重法測量血紅蛋白的實驗原理是根據血液血紅蛋白與比重的關系，將血液滴入己知比重的標準硫酸銅溶液內，觀察血滴懸浮的情況，求出血紅蛋白含量的近似值。不難看出，此法相當粗糙，很難得出精確的結果。其干擾因素很多，有自然因素，也有人為因素。例如：(1)硫酸銅含5個結晶水，易于風化和潮解，不易準確配成各種比重的溶液。(2)多次加入血液后，硫酸銅溶液的比重有所改變，影響沉淀的準確度。(3)滴入的血樣包括血漿和有形成份(血細胞)兩部分，血漿成份(如血脂、血漿蛋白)質和量的改變或血細胞病理性變化(紅細胞的大小及其內在的Hb含量)均與比重有關。因此，單從全血比重角度推測Hb含量，有時會帶來偏差。(4)需要嚴格掌握實驗條件。不但要注意溶液配制時的溫度，試驗時標本與硫酸銅溶液溫度也必須十分接近。有報告指出，在室溫(22℃)的硫酸銅溶液不宜與剛從人體采出的血液(37℃)試驗，這點在冬季尤為重要。另外，實驗時也需嚴格的操作步驟(如加血樣手法、高度、觀察血滴動態變化情況)，這些條件直接影響實驗的準確程度。由于這些不足，衛生部令廢除此項實驗。

二、為什么淘汰血紅蛋白沙利氏比色測定法

　　1895年沙利氏刨用了酸化血紅素法進行Hb的比色測定，在全世界應甩昂近百年，長期以來此法在臨床檢驗中(特別是在基層醫療單位)起了很大作用。但隨著技術的進步和研究工作的深入，其缺點亦日漸突出，現已不能滿足日益發展的臨床醫學的需要。其主要缺點為：(1)不能轉化生理或病理血液中全部的Hb，對碳氧血紅蛋白，還原型血紅蛋白轉化很慢或轉化不完全。(2)由于目視比色，個體觀察的主觀差異較大。(3)血紅蛋白轉化時間較長，5分鐘轉化88％，10分鐘95％，2小時才基本轉化完畢。(4)綸戔反應不明顯，在接近或到達終點時，加入稀釋液后顏色變化不明顯。比色過程不易標準化，往往由于比色板顏色不一致而影響測定結果。(5)色板與轉化液色調不一致，往往給實驗帶來誤差。由于這些因素，此次部長令決定淘汰沙利氏Hb測定法。

替　代　方　法

一、氰化高鐵血紅蛋白(HiCN)測定法及其質量控制

　　為統一Hb測定方法，1966年國際血液學標準化委員會(1CSH)推薦氰化高鐵血紅蛋測定法(下稱HiCN)作為國際Hb測定標準方法。1978年ICSH，國際臨床化學聯合會(1FCC)和世界病理學會聯合會(WASP)發表的國際性文件中重申了HiCN法。1983年中華醫學會臨床檢驗分會桂林會議以來，HiCN法逐漸在國內普及，對Hb測定的標準化起了重要作用。下面著重介紹HiCN法及其有關問題。

（一）HiCN法的優點

　　HiCN法之所以被選為國際標準方法，是因其具備以下幾個重要特點：(1)操作簡單，稀釋液(試劑)為單一試劑。(2)除SHb外，其余Hb衍生物均可很快地轉為HiCN。(3)HiCN在540nm處吸收峰較寬，可用一般分光光度計或濾光板比色計進行測定。(4)顯色快而穩定，因此HiCN液可制成在相當長時間(至少六年)內穩定性不變的標準液，這對進行質量控制工作極為有利。(5)可以通過分光光度法測定直接定值。

（二）實驗原理

　　血紅蛋白被高鐵氰化鉀氧化成高鐵血紅蛋白(Hi)，后者與氰基結合成穩定的棕色氰化高鐵血紅蛋白(HiCN)。在規定的波長和液層厚度的條件下具有一定的吸光系數。因此，根據其吸光度，即可求得Hb濃度。其化學反應式為

　　Hb＋K₃[Fe(CN)₆]→Hi

　　Hi＋CN-→HiCN

(三)試劑

　　經典的HiCN法有二種常用試劑(又稱為轉化液)，其配方為：

　　Drabkin(都氏)液：稱取K₃[Fe(CN)₆)200mg，KCN 50mg和NaHCO₃1g，加蒸餾水至1000ml。

　　Van Kampen—Zijlstra(文齊氏)液：K₃[Fe(CN)₆)200mg，KCN：50mg，KH₂PO₄l40mg，TritionX—100　0.5至lml，加蒸餾水至1000ml。

　　從以上配方可以看出，兩種試劑基本成份一致，唯pH不同。都氏液含有NaHCO₃，pH值8.5，遠離病理性血清蛋白(大多屬于優球蛋白)的等電點。因此，檢查這些病人時不易產生混濁，但反應時間過長(多數40分鐘)為其不足。相反，文齊氏液因其pH值(7.2士0.2)較低，反應較快，5分鐘后即可比色，但因該液的pH值接近于病理性血清蛋白等電點，易產生混濁。目前國內外常用文齊氏液做為常規使用。

(四)操作方法

1．取指血20μl，加到5ml血紅蛋白轉化液中，混勻，靜置5分鐘。

2．用分光光度計(或581G光電比色計)測定。波長540nm(或581G綠色濾光板)，光徑1cm，以蒸餾水或空白轉化液調零，測定吸光度“A”。

3．如果使用符合WHO標準的分光光度計，則可根據測定吸光度“A”直接計算出血紅蛋白濃度：

　　其中A^λ540_HicN為測定管吸光度。64458為Hb分子量。64458／1000為lmmol／LHb溶液中含Hb克數。251為血液稀釋倍數。

(五)有關NiCN測定應注意的問題

1．儀器問題

　　HiCN法優點之一，就是通過分光光度法可直接定值，即Hb(g／L)＝AX 367.7。但使用367.7，這個常數是有條件的，即所測吸光度的分光度計波長必須十分準確，540nm處單色光純度高，吸收池光程為準確的lcm，稀釋倍數為1：251，且測定結果的靈敏度高，線性好。因此，儀器的校正是測定中的關鍵，決定著測定結果的正確與否。校正分光光度計的方法很多。對于HiCN測定最有效、最簡單的校正方法是用特殊的HiCN標準校正液，因為這種溶液有特殊的吸收光譜并可保持6年不變。因此，用同批號的標準液即可根據其光譜特性去校準儀器，又可用其穩定性來監測已校準的儀器。校正大致有以下幾個步驟；

(1)波長：

　　因為標準液吸收峰為540nm，波谷為504nm，故可將校正液放在待測光度計中，從500至580nm分幾個波段測量其吸光度值。如果所得吸光度值的最大吸收峰在540nm，證明儀器波長準確，否則調試儀器有關部分。但在實際工作中對波長偏差不太大的儀器，可采用“將錯就錯”的辦法，即如用HiCN標，準液所得吸收光譜的最好吸收峰是535nm，說明該儀器的535nm，實際上是540nm，實際工作中即可用535nm進行測定。

(2)靈敏度：

　　在實際工作中，特別是基層單位，在無符合標準的分光光度計時，濺得的吸光度(A)往往偏低或偏高。因此不能直接按前文介紹的方法進行計算。但可用HiCN參考液，照一般生化法繪制標準工作曲線或按以下方法求出K值后計算。例如，用定值為50g／L、100g／L、150g／L和200g／L的HiCN參考液，在721型分光光度計上測得吸光度A分別為0.13、0.27、0.405、0.54，則可按下式求出吸光度血紅蛋白換算常數(K)

　　然后根據測定管吸光度“A”，即可用AXK算出血紅蛋白濃度。為方便起見，還可根據K值列出吸光度“A”和Hb(g／L)對照表。

(3)雜光；

　　從單色器到達檢驗器的除檢測所要求的單色光以外，其他波長的光稱為雜光。雜光水平通常以其貢獻的能量與總能量之比的百分數表示。ICSH推薦的HiCN測定法中，規定吸收曲線中波峰(540nm)和波谷(504nm)吸光度之比為Q值，并可由Q值制定HiCN標準校正液的純度。在分光光度計已嚴格校正且無雜光存在的情況下，若測得，Q之值為1．59一1.63，表明該HiCN標準校正液的純度合格。但對純度合格的HiCN標準校正液，雜光的存在可使其吸收光譜的Q值降低(雜光主要使波峰540nm的吸光度下降，而對波谷504nm的吸光度影響不大),故可根據純度合格的HiCN標準校正液的Q值，了解儀器的雜光程度(表1)。

　　表1　純度合格的HiCN標準校正液在不同雜光水平的Q值

(4)線性：

　　在儀器性能測定時，常用一種在一定波長范圍內，確知其服從Beer定律的有色物質配成不同濃度來檢查儀器本身是否能如實反映濃度變化，這就是儀器的線性檢查。Hb測定用的分光光度計線性也可用HiCN標準校正液來檢查。方法是將已知濃度的HiCN液準確稀釋成各種濃度，分別測定。然后以稀釋液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，各點連線應為直線。如有個別點不在直線上，作圖時應使直線通過盡量多的點，將不在直線上的點吸光度與所代表的濃度在直線上的吸光度、比較。一般規定Hb濃度100mg/L以上的點，兩者之差不得超過2％(100mg／L以下的點，可適當放寬)。

(5)吸收池：

　　吸收池的厚度及透光性是影響實驗的又—因素。厚度可用卡尺鑒定，若不是lcm，則測定結果應乘校正系數。透光度可用下述方舉測定：溶解0．2mg伊文氏蘭于100ml蒸餾水中，放入所有待測吸收池內，用一吸收池做標準，將儀器讀數準確調到50％T(透光度。)，將其它吸收池逐一與標準池比較，透光度在50％T士0.5％內者為合格。讀數時應反復交替測定標準池與待測池的透光度，盡量減少儀器漂移的影響。標記吸收池．的透光面，以便在以后應用中，使同一側面向光源。

(6)血紅蛋白吸管和稀釋器的校正：

　　血紅蛋白吸管，稀釋器吸量準確與否直接影響1：251倍稀釋度的準確性，也是產生實驗系統誤差的重要因素之一，定期校正，十分重要。血紅蛋白吸管的校正，通常采用水銀稱重法。

　　將待校正吸管先用清潔液，蒸餾水，酒精乙醚清潔干燥，然后準確吸取AR級水銀至刻度，在注入已稱量的稱量瓶中，在分析天平上稱出水銀重量，根據稱量時的溫度下水銀的密度（表２）即可求出水銀的試劑容量

　　表２　水銀密度與溫度的關系（mg/μl）

待校正吸管實際容量（μl）=

　　舉例：空瓶重21．325g，水銀連瓶重21．599g室溫20℃則：

　　即實際容量偏高1%

　　如容量誤差不超過1％，即可使用，否則應廢棄不用。

2．試劑問題

(1)測定某些含有病理性蛋白血液Hb時，試劑的處理前已述及。經典的HiCN法的試劑有兩種：都氏液和文齊氏液。前者含NaHCO3，呈堿性，病理血液(肝硬變、白血病、腎病)加入后不易產生混濁，但需在15℃條件下40分鐘后才使Hb完全轉化成HiCN。文齊氏液雖顯色快，但因是低離子強度溶液，且其pH值接近病理球蛋白的等電點而易產生混濁。圍繞著? 上述問題許多學者做了深入的研究。Vanzitti發現產生混濁的蛋白屬優球蛋白，其特點是溶解度低，在低離子強度溶液中易沉淀。正常人血漿在pH4．5—6．5環境中可發生混濁，而病理血清則在pH＞7．0條件下發生。進一步研究證實，如在試劑中加入NaCI以增加其離子強度，可抑制這種混濁發生。但Mafsufoara發現，在加入NaCI抑制沉定的同時，也改變了HiCN的Q值，以致影響了測定結果的準確性。為此可以通過調整KH2PO4的濃度，改變PH范圍，使Q值仍保持在正常的1．59—1．63范圍內。目前日本等國使用的松原試驗，即基于此種原理制成，其配方為：K3[Fe(CN)6200mg加KCN50mg,加KH2PO4120mg，加NaCl 5g，加非離子表面活性劑0．5—1ml，加蒸餾水至1000ml。

(2)對碳氧血紅蛋白(HbCO)轉化問題：Berens等報道Hb-CO的存在，可影響測定結果，因為HbCO轉化為HiCN緩慢，有時幾個小時轉化還不完全，且HbCO在540nm時的摩爾吸光系數比HiCN大32％。在吸煙者(血中HbCO濃度高達20％)或接觸CO者測定Hb時，可使結果偏高。Taylor提出延長轉化時間至3小時，或將試劑中K3(Fe(CN)6)濃度加大5倍，(可使轉化時間縮短至5分鐘)均可得到滿意的結果

(3)試劑合格的指標：①外觀應為淡黃色透明溶液，如有變混變綠現象，即應廢去不用。②pH低于7．0時應進行調整，否則與Hb混合后可引起混濁，同時Hi不易與CN結合，而KCN易在酸性條件下以HCN形式逸出。③在波長540nm處，光徑為lcm，以水作空白，試劑A＝0。④都氏液較穩定，4℃條件下可保存一年。文齊氏液不易長期保存，應放在棕色玻璃瓶中，于4℃冰箱內保存。

(4)對含KCN的商品試劑的使用：以上介紹的HiCN的操作。計算及注意的問題針對的是經典的HiCN(即血與文齊氏液或都氏液混合后的HiCN)，而非對所用的含KCN試劑都適? 用。已經證明，目前國內外出售的某些商品試劑雖含KCN，但實際產物并非HiCN。如有些商品試劑內含溴代十六烷，HCN及一些表面活性劑，該試劑與血液反應的產物吸收光譜特點與HiCN不同，此時結果計算就不能使用367．7這個常數。在儀器校正時更應注意此問題。

(5)注意事項：

①血紅蛋白中，KCN為劇毒藥品。雖然濃度較低，但在配制和保存過程中必須提高警惕，防止污染，嚴禁口吸。氰化鉀必須按劇毒藥品管理規定保管。比色后，廢液可按每升加次氯酸鈉液(即安替福民)約35ml比例混勻，敞開過夜，使CN-氧化成CO2和N2揮發，或水解成C032-和NH4＋，再排入下水道。

　　C1Oˉ＋CNˉ→CNOˉ＋C1ˉ
　　2CNOˉ＋3C1Oˉ＋2H₂O→2CO₂↑＋N₂↑十3C1ˉ十2OHˉ
　　CNOˉ＋2H₂O→CO₃^2-＋NH₄^＋

②血紅蛋白不能貯存在塑料瓶中，否則CNˉ下降，使結果偏低。

③分光光度計的波長、狹縫、雜光和比色杯光徑，均應校正。

④標準曲線或K值應定期檢查，校正。

3、質控物問題

(1)HiCN參考液是制備標準曲線，計算K值，校正儀器和其它測定方法的關鍵物質。ICSH已公布了制備方法和嚴格的規格。參考品規格如下：①波峰540土1nm。波谷504～502nm。②A540／A504應在1．59～1．63間。③A750＜0．002。④棕色容器保存，穩定期長，4℃下至少保存6年。⑤無菌試驗(包括厭氧培養)陰性。⑥測定精度＜土1％。⑦定值由指定的多個參考實驗室測定。

(2)開展室內質量控制是提高血紅蛋白測定準確性重要環節。

　　目前采用的質控物有：

　　①全血質控物。可采用新鮮庫血或靜脈采血用ACD或CPD保養液抗凝，混勻后分裝在緊塞小瓶中，儲存4℃冰箱內。全血質控物血紅蛋白和紅細胞計數僅可穩定5周。

　　②半固定醛化紅細胞。這是目前認為既可作血紅蛋白又可作紅細胞計數的質控物。可采用過期庫存血(但不得超過30天)，儲存在4℃環境中，保存期為50～60天。

　　③凍干全血。全血質控物經冰凍干燥后，保存時間較長。

　　④溶血液質控物是最常用的Hb測定質控物。取獻血員抗凝血，用三倍量生理鹽水洗滌3次，除去上清液及白細胞層，最后一次以3000r/min離心30分鐘，倒去上清液，加其半量的蒸餾水，振搖30分鐘，促使紅細胞溶解。移入分液漏斗，加入1／5體積量的甲苯，振搖30分鐘，除去紅細胞膜和脂質。分離出清晰的溶血液，先用3號玻砂漏斗過濾，最后在無菌操作下用6號玻砂漏斗過濾，并分裝在緊塞小瓶或安瓿內，儲存于4℃冰箱中。該溶血液質控物較為穩定，可保存半年以上。

　　近年來，血紅蛋白質控已在全國展開，需要生產大量的Hb質控液，Hb校正液。這些制品不但需要大量的人血為原料，也易造成某些血行傳染病(如：乙、丙肝；艾滋病)的傳播，因此有人以豬血代替人血用于Hb質控，實驗表明收到了滿意的結果。用豬血制備的HiCN液，‘吸收光譜完全符合ICSH頒布的標準。將豬Hb質控液用于不同的常規Hb方法，可得到與人血同樣的結果。豬血來源容易，取血簡單，價格低廉并具有人Hb同樣的質控作用，是人Hb質控制品理想的代用品。