[摘要]
目的：
研究氟康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、5-氟胞嘧啶對948株真菌的體外抗菌活性。方法：真菌收集自2004年1月至2005年4月于北京協和醫院住院患者提供的標本。分別采用酵母菌紙片擴散法敏感試驗，Mueller-Hinton瓊脂中補充2％葡萄糖和0.5mg／L美藍，其他操作類似于美國國家臨床實驗室標準委員會M2-A6細菌藥敏試驗法；以及ATB? FUNGUS 2敏感試驗兩種方法。結果：白念珠菌最常見，占59％，其次為熱帶念珠菌占15％，光滑念珠菌占13％，克柔念珠菌占2％，煙曲霉占2％和近平滑念珠菌占2％、四種藥物對白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌有較高的抗菌活性。結論：抗真菌藥的類型不同，對不同種真菌的體外抗菌活性有較大的差異，伊曲康唑和氟康唑對所研究的酵母菌：白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌有較好的體外抗菌活性。
[關鍵詞]
抗真菌藥；微生物敏感試驗；真菌
真菌感染已成為白血病，淋巴瘤，免疫抑制，長期使用廣譜抗生素，中心靜脈插管，中性粒細胞減少，? 燒傷，低體重的早產兒，高APACHEⅡ積分，血液透析，骨髓或器官移植，胃腸道手術和機械通氣等特殊人群的嚴重感染性疾病。過去臨床對真菌感染的經驗治療主要選擇三唑類利兩性霉素B，但近10年真菌的種類發生了明顯的變化，有高達77％的酵母菌菌血癥是非白念珠菌引起的，它們對抗真菌藥可以產生耐藥性，酵母菌感染的治療面臨新的挑戰[1，2]，因此，對威脅生命的真菌感染的患者，進行真菌藥敏試驗非常重要。為調查真菌對氟康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、5-氟胞嘧啶的敏感性，我們采用紙片擴散法和ATB FUNGUS 2兩種方法測試948株真菌對氟康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、5-氟胞嘧啶的敏感性。
材料與方法
一、菌株來源
從2004年1月至2005年4月北京協和醫院患者臨床血液、尿液、胸腹水、腦脊液和下呼吸道標本中分離出可能致病的948株真菌。見表1、2。采用ChromG A顯色培養基鑒定白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌及克柔念珠菌，其他念珠菌采用VITEK YBC卡鑒定到種的水平。
表1? 948株17種真菌所占百分比
| 菌株 | 株數 | （%） |
白念珠菌 | 573 | 59 |
熱帶念珠菌 | 149 | 15 |
光滑念珠菌 | 126 | 13 |
克柔念珠菌 | 22 | 2 |
煙曲霉 | 22 | 2 |
近平滑念珠菌 | 21 | 2 |
葡萄牙念珠菌 | 11 | 1 |
黃曲霉 | 7 | 1 |
新型隱球菌 | 5 | 1 |
青霉屬 | 4 | 0 |
土曲霉 | 2 | 0 |
季也蒙念珠菌 | 1 | 0 |
念珠菌屬 | 1 | 0 |
無名念珠菌 | 1 | 0 |
鐮刀霉 | 1 | 0 |
頭狀地霉 | 1 | 0 |
釀酒酵母 | 1 | 0 |
表2? 6種真菌在2004年-2005年的分離情況
| 真菌名 | 2004年1-12月 | 2005年1-4月 |
白念株菌 | 468 | 104 |
熱帶念珠菌 | 133 | 15 |
光滑念珠菌 | 95 | 28 |
克柔念珠菌 | 21 | 1 |
近平滑念珠菌 | 13 | 9 |
煙曲霉 | 20 | 2 |
二、抗真菌藥
氟康唑，25μg／片，未開封的紙片-20℃保存，開封后冰箱保存4周。ATB FUNGUS 2試條，含有伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶和兩性霉素B。
三、真菌藥敏試驗法
1．紙片擴散法敏感試驗
采用2003年美國國家臨床試驗室標準委員會(NCCLS)建議的酵母菌紙片擴散法敏感試驗指南，在Mueller-Hinton(MH)瓊脂中補充2％葡萄糖和0.5mg／L美藍[3]，在1L MH瓊脂中，加入0.1ml美藍(methyleneblue，Merck BP 1973產品)貯存液(0.1g美藍加20ml無菌水即為美藍貯存液)和20g葡萄糖。高壓15min，121℃滅菌，水浴至55℃傾入4mm厚平皿備用。敏感試驗其他操作步驟，與標準的細菌紙片法藥敏試驗相似，酵母菌懸液用無菌鹽水比濁至0.5號麥氏管濁度，酵母菌量約為1×106～5×106／ml
2．ATB FUNGUS 2酵母菌敏感試驗
ATB FUNGUS 2試條包括16對凹形杯。第一對不含任何抗真菌劑，用作陽性生長對照。另外的15對包含不同濃度的4種抗真菌劑，用于測定最小抑菌濃度（MIC）。將準備好的待測酵母菌的懸浮液轉移到培養基中，并接種到試條上。孵肓后，通過肉眼判讀凹形杯中液體的生長情況，獲得MIC。試驗條采用手工接種用ATB電子移液管混勻ATB F2培養基，避免產生氣泡，使用ATB電子移液管在每個凹形杯中加入135μl的ATB F2培養基(大約3×104酵母菌／毫升或4×104酵母菌／凹形杯)。將一個蓋子放在試條上，把試條放入一個密閉容器或是—個裝有吸潮紙的GENbox型廣口瓶里，在有氧條件下35℃(±2℃)的環境中，念珠菌屬要培養24小時(±2小時)，新型隱球菌要培養48小時(±6小時)。對念珠菌屬來說，如果在生長質控指示的凹形杯中生長不充分，24小時培養后，很難或是不可能讀出試條的MIC，這時要在同樣的環境下再培養24小時。
四、藥敏指控
采用白念珠菌ATCC90028氟康唑可接受的抑菌環直徑范圍為28-39mm
五、結果判讀
1．紙片擴散法敏感試驗
讀取抑菌環直徑近似到mm，在大約80％抑制區判讀為測量邊界。在抑菌圈邊緣或內部的極微小菌落(<20=可忽略不計，采用BIOMIC電子自動閱讀系統讀取抑菌環直徑(mm)，并自動換算出相應的最低抑菌濃度(MIC)值(mg／L)[4]。氟康唑和5-氟胞嘧啶敏感性的解釋標準見表3。
表3 氟康唑和5-氟胞嘧啶紙片擴散法的抑菌環直徑和相應MIC的解釋標準
| 抗真菌藥 | 氟康唑 | 氟康唑 | 5-氟胞嘧啶 |
抑菌圈直徑/mm | MIC（mg.l/l） | MIC(mg.l/l) | |
敏感（S） | ≥19 | ≤8 | ≤8 |
劑量依賴性敏感（SDD） | 15-18 | 16-32 | 16-32 |
耐藥（R） | ≤14 | ≥64 | ≥64 |
2．ATB FUNGUS 2酵母菌敏感試驗
通過肉眼判讀或是使用ATB儀器自動判讀來觀察生長情況。為方便肉眼判讀，把試條放在黑暗的背景下。對于每一個抗真菌制劑，從低濃度開始，與生長對照杯狀凹比較，記錄每一個杯狀凹的生長得分見表4。對于兩性霉素B，最小抑菌濃度(MIC)應該判斷為省長完全受抑制的測試杯的濃度(即得分為“0”的測試杯)在杯狀凹外圍存在一個(或幾個)散在的菌落或生長跡象，應記錄為“1”分。對于氟康唑，伊曲康唑和5—氟胞嘧啶，鑒定可能存在拖尾生長，最小抑菌濃度(MIC)對應的測試杯得分可以是“2”，“1”，或是“0”分。且在杯狀凹外圍的生長跡象應記錄為“0”或“1”分。[5]
表4．凹形杯的生長與得分
| 定義 | 得分 |
和生長對照完全一樣 | 4 |
比生長對照有輕微減少 | 3 |
比生長對照孔明顯減少 | 2 |
非常微弱的生長 | 1 |
沒有生長 | 0 |
六、數據分析
文中所得表格采用WHO耐藥監測組提供的軟件WHONET5.3分析所得。
結? 果
909株真菌對氟康唑、伊曲康唑、兩性霉素B和5—氟胞嘧啶的藥敏試驗結果見表5。
菌株數<10株的菌種未參加分析，，表5顯示采用紙片擴散法敏感試驗結果：氟康唑對白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌的敏感性為23．8％～100％。采用ATB FUNGUS 2敏感性檢測結果：其中熱帶念珠菌的MIC50為0.125～l，MIC90為0.5～1.6。
四種藥物對白念珠菌、熱帶念珠菌有較高的抗菌活性。氟康唑對光滑念珠菌有較低的抗菌活性，其MIC50和MIC90范圍明顯高于兩性霉素B和伊曲康唑，兩性霉素B和伊曲康唑比氟康唑對這2種念珠菌有較高的抗菌活性。且伊曲康唑和兩性霉素B對煙曲霉有較高的體外抗菌活性。
表5? 6種真菌對抗真菌藥物的體外敏感性
真菌名 | 株數 | 抗真菌藥 | 耐藥% | 中介% | 敏感% | MIC50 | MIC90 | MIC平均值 | MIC范圍 |
白念株菌 | 468 | 氟康唑* | 0 | 1.1 | 98.9 | ||||
104 | 氟康唑 | 7.7 | 0 | 92.3 | 0.5 | 4 | 0.702 | 0.25-256 | |
104 | 伊曲康唑 | 0.125 | 0.5 | 0.195 | 0.016-8 | ||||
103 | 兩性霉素B | 0.5 | 0.5 | 0.497 | 0.25-0.5 | ||||
104 | 5-氟胞嘧啶 | 1.9 | 0 | 97.1 | 0.5 | 0.5 | 0.581 | 0.19-128 | |
熱帶念珠菌 | 133 | 氟康唑* | 0.8 | 0.8 | 98.5 | ||||
15 | 氟康唑 | 6.7 | 6.7 | 86.7 | 1 | 16 | 1.382 | 0.25-128 | |
15 | 伊曲康唑 | 0.125 | 1 | 0.239 | 0.125-4 | ||||
15 | 兩性霉素B | 0.5 | 0.5 | 0.477 | 0.25-0.5 | ||||
15 | 5-氟胞嘧啶 | 0 | 0 | 100 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5-0.5 | |
光滑念珠菌 | 95 | 氟康唑* | 12.6 | 3.2 | 84.2 | ||||
27 | 氟康唑 | 7.4 | 18.5 | 74.1 | 4 | 32 | 4.548 | 0.25-512 | |
26 | 伊曲康唑 | 0.5 | 4 | 0.5 | 0.125-8 | ||||
26 | 兩性霉素B | 0.5 | 0.5 | 0.462 | 0.016-1 | ||||
28 | 5-氟胞嘧啶 | 0 | 3.6 | 96.4 | 0.5 | 0.5 | 0.443 | 0.032-32 | |
克柔念珠菌 | 21 | 氟康唑* | 57.1 | 19 | 23.8 | ||||
1 | 氟康唑 | 64 | 64 | 64 | 64-64 | ||||
1 | 伊曲康唑 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5-0.5 | ||||
1 | 兩性霉素B | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5-0.5 | ||||
1 | 5-氟胞嘧啶 | 2 | 2 | 2 | 2-2 | ||||
近平滑念株菌 | 13 | 氟康唑* | 0 | 0 | 100 | ||||
8 | 氟康唑 | 0.5 | 8 | 0.771 | 0.5-8 | ||||
9 | 伊曲康唑 | 0.125 | 0.5 | 0.135 | 0.062-0.5 | ||||
9 | 兩性霉素B | 0.5 | 0.5 | 0.429 | 0.125-0.5 | ||||
9 | 5-氟胞嘧啶 | 0.5 | 0.5 | 0.355 | 0.023-0.5 | ||||
煙曲霉 | 17 | 伊曲康唑 | 0.5 | 1.5 | 0.588 | 0.19-2 | |||
18 | 兩性霉素B | 0.25 | 6 | 0.379 | 0.006-64 | ||||
15 | 5-氟胞嘧啶 | 1 | 64 | 2.014 | 0.032-64 |
討論
本研究提示：氟康唑對白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠閏有較高的抗菌活性。文獻報道真菌血流感染自1980年的5.4％增加至1990年的9.9％，念珠菌菌血癥的病死率為38％[6]。在美國流行病學研究發現，白念珠菌過去是最常見的念珠菌病的病原菌，但近來檢測結果提示白念珠菌僅為55％，非白念珠菌為45％[6]對煙曲霉而言，伊曲康唑比兩性霉素B有較低的MIC值，伊曲康唑對煙曲霉有較高的抗菌活性。對非白念珠菌中的光滑念珠菌和克柔念珠菌，伊曲康唑對光滑念珠菌的抗菌活性低于兩性霉素B，氟康唑對這兩種念珠菌顯示出較高的耐藥性，尤其對克柔念珠菌。本研究結果表明：抗真菌藥的類型不同，對不同種真菌的體外抗菌活性有較大的差異，伊曲康唑和氟康唑對所研究的酵母菌：門念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌有較好的體外抗菌活性；伊曲康唑、兩性霉素B對煙曲霉有較高的抗菌活性；氟康唑對克柔念珠菌和部分光滑念珠菌表現出較高的耐藥性，但伊曲康唑試驗株數較少，無法評估。
參考文獻
1．徐英春，王澎，陳民鈞．輝瑞公司全球多中心酵母菌敏感性監測結果[J]．中國抗感染化療雜志，2003，3(3)：187—190
2．Wenzel R, Brewer TF, Butzler JP, et al. fungi, A guide to infection control in the hospital(2nd Edition),international society for infection diseases[M].Boston,MA.USA,BC Decker Inc Hamilton.London,2002,157-159
3．National Committee for Clinical Laboratory Standards.Method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts;proposed guideline[S].NCCLS M44-P,2003,123：6
4．Berke I,Tierno PM Jr. Comparison of efficacy and costeffectiveness of BIOMIC video and Vitek antimicrobial susceptibility test systems for use in the clinical microbiology laboratory [J].J Clinical Microbiology,1996,34：1980-1984
5．徐英春，王澎，原英等.氟康唑和伏立康唑對酵母菌抗菌活性的研究[J].中國抗感染化療雜志 2003，3（5）：277-279
6．Rangel-Frausto MS,Wiblin T, Blumberg HM,et al.National Epidemiology of Mycoses Survey.Variations in rates of Candida Bloodstream Infections due to candida species in Seven surgical ICUs and six Neonatal ICUs[J].Clin Infect Dis 1999,29：253-258