3．16S rRNA同源性分析
(1)
rRNA-DNA雜交：變性rRNA與變性DNA混合時，rRNA與其互補的DNA鏈形成雜交雙鏈，rRNA分子與異源DNA雜交時，也能在其同源區形成互補雙鏈，這種雜交雙鏈的穩定性與其同源性成正相關，適于細菌屬及屬上水平的分類研究。現最常用的是硝酸纖維膜結合法。
(2)16S
rRNA序列測定：rRNA分子具有高度保守性，在所有的細胞生物中都存在，在長期的進化中，16S
rRNA的總堿基數有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互對齊進行比較。1985年Lane等提出了改良的Sanger雙脫氧鏈終止法測定rRNA序列，以rRNA為模板，以一個或多個寡核苷酸鏈做引物（與rRNA分子上的一段保守區域互補的15~20個核苷酸），用反轉錄酶合成反轉錄DNA。隨著PCR技術的成熟，出現了利用PCR技術擴增16S
rRNA基因（rDNA），然后采用Sanger法分析rDNA序列的方法，該法比前者更方便。當前的細菌分類要求測定16S
rRNA基因的全序列來進行比較。16S rRNA基因序列分析技術是建立系統分類的主要技術，有人建議DNA相關性≥70%，16S
rRNA序列差異≤1%~1.5%的細菌屬于同一種，這使細菌的種有一個穩定和統一的標準。
二、分子生物學技術在細菌鑒定中的應用
十九世紀，細菌的鑒定主要依靠細菌的表型特征，因耗時長，往往耽誤了對疾病診斷與治療。隨著分子生物學技術的發展及在臨床微生物學檢驗中的應用，為微生物學實驗室對細菌的快速鑒定，尤其是對難分離細菌的快速鑒定，提供了有利條件。目前在細菌鑒定中應用的分子生物學技術主要有核酸探針和核酸擴增技術等。
1．核酸探針技術
應用核酸探針技術檢測病原微生物核酸是臨床診斷學的重大發展，其原理是用帶有酶、化學熒光物、放射性核素或生物素標記的已知序列特定DNA片段（稱為探針），在一定條件下，按堿基互補原則探針與待測標本中的核酸雜交，通過對雜交信號的檢測，從而鑒定標本中有無相應的病原微生物基因及其分子大小。常用核酸探針技術有固相雜交（斑點雜交、原位雜交、Southern印跡、Northern印跡等。）和液相雜交技術。
核酸探針適用于直接檢出臨床標本中的病原微生物，不受非病原微生物的影響，因此對某些尚不能分離培養或很難分離培養的微生物的檢測具有重要的意義。隨著探針標記的不斷改進，檢測試劑盒商品化，操作更簡便易行。
核酸擴增技術
核酸擴增（又稱基因或DNA擴增）技術是體外酶促合成DNA片段的新方法，其原理類似于DNA的體內半保留復制。主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環構成。即在高溫下（95℃）下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫（37~55℃）情況下，兩條人式合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃）下，以引物的3`端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以5`
3`方向延伸，合成DNA新鏈。這樣每一雙鏈DNA模板，經過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進行，每一次循環所產生的DNA均能成為下一次循環的模板，每一次循環都使人工合成的引物間的DNA特異區段拷貝數擴增一倍。經過上述25~40個循環后，靶序列可以擴增成106~108。
核酸擴增技術（或稱聚合酶鏈反應技術，PCR）具有高敏感性、高特異性、簡便、快速等特點，臨床實驗室常用PCR技術來檢測標本中某些微生物，尤其是對難以培養微生物的檢測。其它用于檢測微生物的PCR技術還有：RT-PCR、巢式PCR、多重PCR和隨機引物PCR等。核酸擴增技術在臨床微生物學檢驗中的應用見表6-4-2。
表6-4-2 核酸擴增技術在臨床微生物學檢驗中的應用
微生物種類 核酸擴增技術 應 用
金黃色葡萄球菌 多重PCR 對mecA基因檢測
凝固酶陰性葡萄球菌 多重PCR 對mecA基因檢測
肺炎鏈球菌 PCR 自溶酶和青霉素結合酶的檢測
化膿性鏈球菌 PCR M蛋白基因的菌株分型
淋病奈瑟菌 LCR 尿道分泌物標本直接檢測
百日咳桿菌 PCR、巢式PCR 臨床標本檢測
結核分枝桿菌
PCR、SDA、Qbeta 肺結核的診斷、呼吸道標本檢測、臨床標本直接檢測
鳥分枝桿菌復合群 PCR 鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌的區別
白喉棒狀桿菌 PCR 產毒菌株的檢測
腸致病性大腸埃希菌 多重PCR 產毒菌株檢測
傷寒、副傷寒沙門菌 PCR 耐藥質粒分型和檢測
幽門螺桿菌 多重PCR 胃活檢組織細菌檢測
小腸結腸炎耶爾森菌 PCR 菌株分型
彎曲菌屬 PCR 通過16s rRNA鑒定
杜克雷嗜血桿菌 多重PCR 生殖道潰瘍病人的直接檢測
嗜肺軍團菌 PCR 與爆發相關菌株的分型
金氏桿菌屬 PCR 臨床標本鑒定
念珠菌屬 PCR 通過“DNA”指紋鑒定
梅毒螺旋體 多重PCR 生殖道潰瘍標本直接檢測
伯氏螺旋體 巢式PCR 治療前、中、后檢測
問號狀鉤端螺旋體 PCR 鉤端螺旋體血清型的鑒定
CDC group Ⅳ 群 PCR 分型
沙眼衣原體 PCR 無癥狀病人的診斷
三、分子生物學技術在細菌藥敏試驗中的應用
分子生物學技術在檢測耐藥基因方面日益受到重視。臨床上可用PCR方法檢測耐藥基因，來判斷待檢菌對某種抗菌藥物是否具有耐藥性。但某些沉默耐藥基因，如不表達相應產物，則可能不表現耐藥表型。現在已有檢測耐藥基因的DNA探針和PCR商品化試劑盒供應，但多用于實驗研究，常規工作中開展較少。目前能檢測的耐藥基因有：
β-內酰胺類
mecA、blaTEM、blaROB-1、blaSHV、blaIMP、blaMIR-1、blaOXA、blaPER-1、blaPER-2、blaOXY-1、blaOXA-10/11。
氨基糖苷類
aph（3’）—Ⅲ、aph（3’）—Ⅵ、ant（2〃）Ia、ant（4’）-Ia、aac（3）
-Ia、acc（6’）-Ia、aac（3）-Va、aac（6’）-aph（2〃）、ant（4’）、ant（6’）-Ia、aac（6’）-Ic、aac（3）-Ib、aad（2〃）-Ia、ant（6）-I、aph（2〃）-Ic。
氯霉素
catP、catQ、catD、catI
環內酯類
ereA、ereB、ermA、ermAM、ermC、ermF、smp、mphA、mefA、vat。
磺胺類
sulⅠ、sulⅡ,sulA。
四環素
tet（A）、tet（C）、tet（D）、tet（K）、tet（L）、tet（M）、tet（O）、tet（P）、tet（S）、tet（Q）、tet（U）、tetA（P）。
甲氧芐啶
dhfrⅠ、dhfrⅡ、dhfrⅢ、dhfrⅤ、dhfrⅦ、dhfrⅨ、dhfrⅩ、dfrA、folH、dhfrⅧ。
8．糖肽類
vanA、vanB、vanB2, vanC1、vanC3、vanD。
9．喹諾酮類
gyrA、gyrB、parE。
10．乙胺丁醇
embB。
11．吡嗪酰胺
pncA。
12．利福平
rpoB。
13．鏈霉素
rpsL、rrs。
14．異煙肼
katG、inhA、ahpC。
第六節 自動化技術在微生物檢驗中的應用
微生物鑒定的自動化技術近十幾年得到了快速發展。數碼分類技術集數學、計算機、信息及自動化分析為一體，采用商品化和標準化的配套鑒定和抗菌藥物敏感試驗卡或條板，可快速準確地對臨床數百種常見分離菌進行自動分析鑒定和藥敏試驗。目前自動化微生物鑒定和藥敏分析系統已在世界范圍內臨床實驗室中廣泛應用。本節簡要介紹有關情況。
一、微生物數碼鑒定法
早在七十年代中期，一些國外公司就研究出借助生物信息編碼鑒定細菌的新方法。這些技術的應用，為醫學微生物檢驗工作提供了一個簡便、科學的細菌鑒定程序，大大提高了細菌鑒定的準確性。目前，微生物編碼鑒定技術已經得到普遍應用，并早已商品化和形成獨特的不同細菌鑒定系統。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系統。這種鑒定系統是自動化鑒定系統的基礎。
( 一)數碼鑒定法基本原理
數碼鑒定是指通過數學的編碼技術將細菌的生化反應模式轉換成數學模式，給每種細菌的反應模式賦予一組數碼，建立數據庫或編成檢索本。通過對未知菌進行有關生化試驗并將生化反應結果轉換成數字（編碼），查閱檢索本或數據庫，得到細菌名稱。其基本原理是計算并比較數據庫內每個細菌條目對系統中每個生化反應出現的頻率總和。隨著電腦技術的進步，這一過程已變得非常容易。
1．簡要介紹計算步驟：
(1)出現頻率（概率）的計算：將記錄成陽性或陰性結果轉換成出現頻率：①對陽性特征，則除以100即得。②對陰性特征，除以100的商被1減去即可。③說明：對“0”和“100”，因這2個數太超量，為了使結果不出現過小或過大，而用相似值0.01或0.99值代替。
(2)在每一個分類單位中，將所有測定項目的出現頻率相乘，得出總出現頻率。
(3)在每個分類菌群中的所有菌的總出現頻率相加，除以一個分類單位的總出現頻率，乘100，即得鑒定%（%id）
(4)在每個菌群中，再按%id值大小順序重新排列。將未知菌單次總發生頻率除以最典型反應模式單次總發生頻率，得到模式頻率T值，代表個體與總體的近似值。T值越接近1，個體與總體越接近，鑒定價值越大。按%id大小排序，將相鄰兩項的%id之比為R，代表著首選條目與次選條目的差距，差距越大，價值越大。如果%id≥80，參考T及R值可作出鑒定。
2．在編碼檢索本中檢索數據譜得出的結果有以下幾種形式（以API鑒定系統為例）。
(1)有此數碼譜:①有一個或幾個菌名條目及相應的鑒定值（%id和T值）。②對鑒定結果好壞的評價，最佳……等。③用小括號列出關鍵的生化結果及陽性百分率。④有時，鑒定結果不佳或有多條菌名條目,需進一步補充試驗項目才能得出良好的鑒定結果。⑤指出某些注意要點，需用“推測性鑒定”，并將此菌送至參考實驗室；需用“血清學鑒定”，作進一步的證實等。
(2)無此數碼譜：可能有以下原因：①此生化譜太不典型。②不能接受，鑒定值低(%id＜80.0)。③可疑。需進一步確認是否純培養，重新鑒定，可與供應商技術服務部聯系。
3. 結果解釋
(1)如果排序第一的細菌%id≥80.0，則可將未知菌鑒定在此條目中，并按%id值的大小對鑒定的可信度作出評價。%id≥99.9和T≥0.75為最佳的鑒定；%id
99.0~98.9之間，T≥0.5為很好的鑒定；%id 90.0~98.9之間，T≥0.25為好的鑒定；%id
80.0~89.9之間為可接受的鑒定。
(2)如果第一條目的%id＜80.0，則將前2個條目的%id加在一起，若仍不足80.0，則將前3個%id相加。若≥80.0，則有2種可能：①為同種細菌，可能是不同生物型。②為同一菌屬的不同種。
如果相加的幾個條目既不屬于同一細菌種，又不屬于同一細菌屬，在評價中會指出“補充生化反應”的項目及陽性反應率，可通過這些生化反應將幾種菌區分開來。若前3個條目的和＜80.0，則為不可接受的結果。
(二)數碼鑒定在臨床上的應用
國內外已有許多種用于臨床細菌鑒定的數碼鑒定系統，為臨床微生物學實驗室對細菌的鑒定提供了簡便、快速的方法。目前常見微生物鑒定系統見表6-4-3
表6-4-3 目前常見微生物鑒定系統
生產廠商 系統名稱 可鑒定的微生物 孵育時間及條件
ANI 厭氧菌 ４h；需氧
API20A 厭氧菌 2４h；厭氧
API An-IDENT 厭氧菌 ４h；需氧
API Staph（STAPH－Trac） 葡萄球菌、微球菌 2４h
GPI 革蘭陽性球菌和桿菌 2~15h
ID32 Staph 葡萄球菌 24h
API Coryne(Rapid CORYNE) 棒狀桿菌及相關菌 24h
API 20Strep(Rapid STREP) 鏈球菌、腸球菌 ４~24h
API 20E 腸桿菌科、非發酵菌 2４~48h
EPS (Enteric Pathogen Screen） 愛德華菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、耶爾森菌屬 ４~8h
GNI 腸桿菌科、非發酵菌 2~18h
GNI＋ 腸桿菌科、非發酵菌 2~12h
UID／UID-3 尿液來源尿道致病菌 1~13h
YBC 酵母菌 24~48h
API 20C AUX 酵母菌 48~72h