分子生物學常用實驗技術（五）

第四章RNA 的提取和cDNA 合成

　　第一節概述

　　從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,通過酶促反應逆轉錄合成cDNA 的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA 和載體連接,然后轉化擴增, 即可獲得cDNA 文庫,構建的cDNA 文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調控的分析;比較cDNA 和相應基因組DNA 序列差異可確定內含子存在和了解轉錄后加工等一系列問題。總之cDNA 的合成和克隆已成為當今真核分子生物學的基本手段。自70 年代中葉首例cDNA 克隆問世以來,已發展了許多種提高cDNA 合成效率的方法,并大大改進了載體系統，目前cDNA 合成試劑已商品化。cDNA 合成及克隆的基本步驟包括用反轉錄酶合成cDNA 第一鏈,聚合酶合成cDNA 第二鏈,加入合成接頭以及將雙鏈DNA 克隆到于適當載體(噬菌體或質粒)。

一、RNA 制備
　　模板mRNA 的質量直接影響到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的結構特點,容易受RNA 酶的攻擊反應而降解,加上RNA 酶極為穩定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA 酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA 酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2 小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈。DEPC 是RNA 酶的化學修飾劑,它和RNA 酶的活性基團組氨酸的咪唑環反應而抑制酶活性。DEPC 與氨水溶液混合會產生致癌物,因而使用時需小心。

　　試驗所用試劑也可用DEPC 處理,加入DEPC 至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10 分鐘,再煮沸15 分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC 也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA 活性。但DEPC 能與胺和巰基反應,因而含Tris 和DTT 的試劑不能用DEPC 處理。Tris 溶液可用DEPC 處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC 處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC 外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復合物、RNA 酶抑制蛋白等。此外,為了避免mRNA 或cDNA 吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需經硅烷化處理。
細胞內總RNA 制備方法很多,如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現成的總RNA 提取試劑盒,可快速有效地提取到高質量的總RNA。分離的總RNA 可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特點,當RNA 流經oligo (dT)纖維素柱時,在高鹽緩沖液作用下,mRNA 被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上,然后逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA 被洗下。經過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。純化的mRNA 在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

二、cDNA 第一鏈的合成
　　所有合成cDNA 第一鏈的方法都要用依賴于RNA 的DNA 聚合酶(反轉錄酶)來催化反應。目前商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney 鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶。AMV 反轉錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴于RNA 的DNA 合成,依賴于DNA 的DNA 合成以及對DNA:RNA 雜交體的RNA 部分進行內切降解(RNA 酶H 活性)。MLV 反轉錄酶只有單個多肽亞基,兼備依賴于RNA 和依賴于DNA 的DNA 合成活性,但降解RNA NA 雜交體中的RNA 的能力較弱,且對熱的穩定性較AMV 反轉錄酶差。MLV 反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反轉錄酶和MLV 反轉錄酶利用RNA 模板合成cDNA 時的最適pH 值,最適鹽濃度和最適溫室各不相同,所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要。AMV 反轉錄酶和MLV 反轉錄酶都必須有引物來起始DNA 的合成。cDNA 合成最常用的引物是與真核細胞mRNA 分子3'端poly(A)結合的12-18 核苷酸長的oligo(dT)。

三、cDNA 第二鏈的合成
　　cDNA 第二鏈的合成方法有以下幾種:
(1) 自身引導法合成的單鏈cDNA 3'端能夠形成一短的發夾結構,這就為第二鏈的合成提供了現成的引物,當第一鏈合成反應產物的DNA:RNA 雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段或反轉錄酶合成cDNA 第二鏈,最后用對單鏈特異性的S1 核酸酶消化該環,即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1 核酸酶切割發夾結構時無一例外地將導致對應于mRNA 5'端序列出現缺失和重排,因而該方法目前很少使用。
(2) 置換合成法該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產生的cDNA:mRNA 雜交鏈不用堿變性,而是在dNTP 存在下,利用RNA 酶H 在雜交鏈的mRNA 鏈上造成切口和缺口。從而產生一系列RNA 引物,使之成為合成第二鏈的引物,在大腸桿菌DNA 聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應有3 個主要優點: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一鏈反應產物,無須進一步處理和純化; (3) 不必使用S1 核酸酶來切割雙鏈cDNA 中的單鏈發夾環。目前合成cDNA 常采用該方法。

四、cDNA 的分子克隆
　　已經制備好的雙鏈cDNA 和一般DNA 一樣,可以插入到質粒或噬菌體中,為此,首先必需連接上接頭(Linker),接頭可以是限制性內切酶識別位點片段,也可以利用末端轉移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG 和dC 或dT 和dA 尾巴,退火后形成重組質粒,并轉化到宿主菌中進行擴增。合成的cDNA 也可以經PCR 擴增后再克隆入適當載體。

第二節動植物組織mRNA 提取
一、材料
　　 水稻葉片或小鼠肝組織。

二、設備
　　研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。

三、試劑
1、無RNA 酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180℃ 2 小時）裝蒸餾水，然后加入0.01%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。
2、75%乙醇：用DEPC 處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。
3、1×層析柱加樣緩沖液；20mmol/L Tris?Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。
4、洗脫緩沖液：10mmol/L Tris?Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。

四、操作步驟
（一）動植物總RNA 提取-Trizol 法
　　Trizol 法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA 絕無蛋白和DNA 污染。RNA 可直接用于Northern 斑點分析，斑點雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase 封阻分析和分子克隆。
1、將組織在液N 中磨成粉末后，再以50-100mg 組織加入1ml Trizol 液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol 體積的10%。
2、研磨液室溫放置5 分鐘，然后以每1mlTrizol 液加入0.2ml 的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15 秒。
3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol 液加0.5ml 異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10 分鐘，12000g 離心10 分鐘。
4、棄去上清液，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5 分鐘。
5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10 分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA 的溶解度。然后將RNA 溶于水中，必要時可55℃-60℃水溶10 分鐘。RNA 可進行mRNA 分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。
　　　　2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA 沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

（二）mRNA 提取
　　由于mRNA 末端含有多poly(A)+，當總RNA 流徑oligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下，
mRNA 被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA 可被洗下，經過兩次
oligo(dT) 纖維素柱，可得到較純的mRNA。

1、用0.1mol/L NaOH 懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。
2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經DEPC 處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯
德吸管中，柱床體積為0.5-1.0ml，用3 倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。
3、用1x 柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH 值小于8.0。
4、將（一）中提取的RNA 液于65℃溫育5 分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x 柱層析緩沖
液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA 溶液進入柱床后，加入1 倍柱床體積的1x 層析
柱加樣溶液。
5、測定每一管的OD260，當洗出液中OD 為0 時，加入2-3 倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以
1/3 至1/2 柱床體積分管收集洗脫液。
6、測定OD260，合并含有RNA 的洗脫組分。
7、加入1/10 體積的3M NaAc(pH5.2)， 2.5 倍體積的冰冷乙醇， 混勻， -20℃30 分鐘。
8、4℃下12000g 離心15 分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g 離心
5 分鐘。
9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10 分鐘，或真空干燥10 分鐘。
10、用少量水溶解RNA 液，即可用于cDNA 合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。
[注意] 1、mRNA 在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
　　　2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH 洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復使用。每次用前需用NaOH 水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。第三節植物病毒RNA 提取大多植物病毒RNA 為單鏈RNA，并且其極性與mRNA 極性相同，植物病毒RNA 提取較為簡單，一般使用酚氯仿即可獲得滿意結果。