食物過敏原檢測及其應用前景

 
　  過敏性疾病影響全世界近四分之一的人口，被世界衛生組織列為21世紀重點防治的三大疾病之一。其中對食物的不良反應備受人們關注，大約30％的成年人在一生中至少有1次以上對食物不良反應的經歷，20％～65％的過敏性腸道綜合征和消化不良患者的病因與食物過敏有關。目前惟一有效的治療方法是避免食用過敏的食物，而檢測患者對何種食物過敏就顯得尤為重要。食物過敏原的研究是檢測試劑研發，過敏機制研究的重要基礎，現對當前食物過敏原的檢測方法及常見過敏原的研究進展綜述如下。

一、食物過敏原的檢測方法

(一)雙盲食物激發試驗

雙盲食物激發試驗(double-blind，placebo-controlledfoodchallenge，DBPCFC)為診斷食物過敏的金標準，主要用于以下情況：
 
(1)幾種食物同時被懷疑為過敏原且特異性IgE(specific IgE，sIgE)陽性，為減少患者禁食種類時可使用；(2)高度懷疑某一過敏物，但無sIgE抗體的證據，為進一步確定進食該食物的安全性時使用；(3)非IgE介導型食物過敏者多用該方法。患者應先進行排除飲食，然后施以食物刺激，在操作過程中為控制偏倚，可不讓患者知道進食食物的種類或使用安慰劑，但對反應較嚴重的IgE陽性的過敏原。不宜做該試驗。由于該試驗有一定危險性，且近年來有證據表明定量IrE檢測可預測DBPCFC的試驗結果，結合臨床病史多數食物過敏可得到確診，故真正需進行DBPCFC的患者并不多。

(二)皮膚針刺試驗(skinpricktest，SPT)

SPT為臨床常用的檢測過敏原特異性IrE的體內試驗。具體方法為用稀釋抗原液點刺皮膚，同時進行陰、陽性對照，15min后觀察檢測點是否出現風團或潮紅反應，如風團直徑超過陰性對照3 mm則為陽性，表明存在與過敏原IgE結合的肥大細胞。SPT最顯著的優點是價格便宜，快速，而且可讓有疑心的患者看到結果；但許多因素如季節，測試時間，待測區域，藥物等都會影響其結果，且所用的蔬菜、水果等過敏原提取物缺乏穩定的蛋白，故該法的重現性較差。同時，不同地區及醫院所檢測的過敏原種類、濃度、判別標準及質控措施有很大差別，這使醫院間共用結果受到限制。

(三)體外8IgE檢測

與體內試驗相比，體外檢測具有效能參數可靠，不受藥物影響，無全身反應危險等優點，在下列情況下首選：(1)對過敏原極度敏感；(2)皮膚異常；(3)患者服用干擾皮膚反應的藥物；(4)患者不合作或拒絕皮膚檢測；(5)患者處于嚴重過敏反應后由于巨細胞介質耗盡所致的不應期。近年來，體外sIgE檢測技術有了很大的發展。

1．放射過敏原吸附試驗(radio allergosorbent test，RAST)：RAST為最早使用的過敏原檢測方法。其主要原理是將過敏原結合到固定相，加入待測血清及參考對照，血清內存在的過敏原-slgE將吸附在固定相上，通過用放射性同位素標記的抗IrE二抗來檢測血清中的8IgE。由于該法費用昂貴，花費時間長，放射性同位素易過期且污染環境，不同來源試劑盒的參比血清不同而不易相互比較，待檢血清含有相同特異性IgG時可干擾正常結果，故目前已逐漸被測定帽(CAP)過敏原檢測法所代替。

2．測定帽(CAP)過敏原檢測系統是目前國際上廣泛應用并公認較為可靠的過敏原定量體外檢測系統，主要原理為酶聯免疫熒光測定法(fluorescent enzyme immunoassays，FEIA)。CAP系統建立于新型固體相——裝在小膠囊中的親水性載體聚合物上，由一種經溴化氰活化的纖維素衍生物合成，與過敏原有極高的結合能力。其過程為將50標準血清或患者血清加入到固有相，再將酶標抗IgE二抗加入到固有相中，最后測定熒光并與標準曲線比較。CAP過敏原檢測法測定范圍為0．35～100KU^／L(A：allergen sIgE)，變異系數(CV)<10％。通常以sIgE>0．35KU^／L為臨界點(即陽性反應)，其陰性預報正確率達95％，敏感性也高達94％～100％，但其特異性較差，陽性預報正確率(positive predictive values，PPV)則更低。若根據情況調整臨界點，則可提高其特異性和PPV。該系統可分析常見的6種食物過敏原：雞蛋、牛奶、花生、大豆、小麥和魚。

3．進口試劑和方法：目前，有許多快速檢測sIgE的商用試劑盒，如德國MEDIWISS公司生產的Allergy Screen系統，該系統為半定量免疫印跡試驗，檢測板中的硝酸纖維素膜上包被有過敏原，依次加入250血清、生物素標記的抗人IrE抗體和堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素，最后經BCIP／NBT底物顯色，檢測板上相應的過敏原條帶處將會出現紅色，顏色的深淺與血清中sire含量成正比。檢測板經Rapid閱讀儀攝像和配套軟件分析，將結果分為0～6級，>2級為陽性結果，該法可同時檢測十幾種食物過敏原及總IrE，特異性及敏感性較好。再如美國ASI公司生產的過敏反應體外檢測系統(簡稱IVT法)，由1只反應管組成，反應管中含有一系列塑料段，在這些塑料段的表面包被有單一過敏原、過敏原混合物或單克隆抗體。患者血清中的sIgE抗體可以與他們分別反應，形成免疫復合物后沉淀下來，隨后加入酶及底物，根據顏色反應判斷陰、陽性，該法特異性較好，但耗時較長。另外，許多全自動免疫分析儀都配有相應的過敏原檢測試劑盒，如美國梅里埃的Stallertest檢測系統，s0hn等試驗證明該系統與UNICAP有很好的相關性，再如ALK-Abello開發的ADVIACentaur免疫分析系統，其敏感性及特異性與UNICAP相似，且具有用血量少，快速出報告，無IgG干擾等優點，但這些方法的儀器試劑都很昂貴。

4．生物芯片：近年來，漸趨成熟的蛋白質芯片技術因其高通量、微型化、平行性檢測等優點，正越來越多的應用于藥物篩選、腫瘤標志篩查J、臨床檢測等領域，被看作是最有前景的診斷工具。Fall等將抗原液固化于活化顯微玻璃上，用化學發光系統檢測slgE，與Pharmacia CAPFEIA等方法比較，該法重現性及靈敏性較好，用血量僅為25l，且檢測時間為1h以內。Wohrl等用微芯片技術檢測過敏原也取得了類似的結果。Matsuya等用實時分辨熒光微芯片檢測過敏原sIgE，與CAP／BASTFEIA比較有很好的相關性。盡管近年來蛋白芯片檢測過敏原有了很大發展，但有幾個問題仍需解決：(1)玻璃基質本身的缺陷、芯片表面微塵的聚集及去濕化使蛋白芯片極易產生人為信號，而這些干擾信號是操作者不能簡單識別的，因此，必須建立嚴格的標準以評估結果；(2)蛋白芯片點樣不準確，批問差異較大，這還需通過點樣技術的提高來克服。

(四)生物共振技術

目前，生物共振技術在食物過敏原檢測中的應用受到越來越廣泛的關注。該技術的基石是法國科學家DeBroglie的物質波理論，根據該理論，每種物質都會產生特有的物質波即共振波，此共振信息可被采集、放大、削弱。過敏是一種生物物理信息現象，該現象在人體內產生需要過敏印痕的出現，這種過敏印痕來源于物質與人體的多次接觸，然后逐漸產生基于物質信息的生物物理印痕，一旦人體產生了這種印痕信息，它就可能被維持并處于休眠狀態，當再次接觸過敏源時印痕被激活，并進而通過生物物理脈沖誘發常見的變態反應疾病。每種過敏印痕的信息是此種過敏原惟一的生物物理共振模式，使用共振技術可將致敏信號檢測出來。德國BICOM2000型生物共振過敏原檢測治療系統就是以此原理運作的。該系統可檢測上百種食物過敏原，有特殊情況的病人可自帶可疑過敏原進行檢測。該技術檢測過敏原的特點是無創、快速、檢測范圍廣，無創傷性，極易在兒童中推廣。但該技術對食物過敏診斷的意義，其科學性、合理性等還有待證實，其特異性、敏感性、重復性等還值得進一步探討。

二、常見食物過敏原的研究進展

因各種過敏原檢測試劑都用到重組或提取的過敏原且過敏原在過敏性疾病的治療中起重要作用，故對過敏原進行研究具有重要意義。食物過敏原一般為相對分子質量10000～70000的蛋白質或糖蛋白，可分為主要過敏原與次要過敏原，大多數過敏患者對主要過敏原敏感。

(一)甲殼類動物及其產品

隨著海產品受到越來越多人的青睞，這類食物過敏反應的報道也逐漸增多。其中，蝦過敏原備受關注，據報道0．6％～2．8％的過敏性疾病患者對蝦過敏。人們在蝦肉中檢測出至少13種IgE結合蛋白，但原肌球蛋白被鑒定為惟一的主要過敏原，相對分子質量介于34000～39000之間。據報道，原肌球蛋白是蝦、蟹、牡蠣、烏賊等無脊椎動物的重要抗原，具有高度保守的氨基酸序列。

(二)蛋類及其產品

雞蛋是兒童食物過敏反應最常見的原因之一，其陽性率在兒童食物過敏中達35％，而成人過敏也高達12％。蛋白的主要過敏原為卵類黏蛋白Galdl(相對分子質量為28000)、卵白蛋白Gald2(相對分子質量為44000)、卵傳鐵蛋白Gald3(相對分子質量為77000)和溶菌酶Gald4(相對分子質量為14000)；蛋黃的主要過敏原為Ot卵黃蛋白(相對分子質量為70000)。據報道，雞蛋過敏中，蛋白比蛋黃更易引起過敏，卵類黏蛋白為主要過敏原。

(三)牛奶與奶制品

小于2歲的兒童牛奶過敏率為1．6％～2．8％，50％～9o％的兒童在6歲前轉為耐受。牛奶主要過敏原為酪蛋白(Bosd8，相對分子質量為20000～30000)、B哥L球蛋白(Bosd5，相對分子質量為18000)、Ot．乳白蛋白(Bosd4，相對分子質量為14000)、牛血清白蛋白(Bosd6，相對分子質量為67000)和牛免疫球蛋白，其中酪蛋白的免疫原性與抗原性最強。牛奶抗原相對穩定，在常規處理后可保持其免疫原性。

(四)花生及其產品

由于花生過敏反應的嚴重性及高發性，該過敏原引起醫療機構的廣泛關注。據報道食物誘導的過敏反應中，花生過敏占10％～47％。主要花生過敏原為Arah1(相對分子質量為63500)，Arah2(相對分子質量為17000)，其他相關抗原有Arah3(相對分子質量為60000)，Arah4(相對分子質量為14000)。次要抗原有Arah6、Arah7及肌動蛋白。經ELISA抑制試驗證實Arah2是引起花生與榛子、杏仁等交叉反應的主要抗原。不同的食物處理方式對花生抗原有不同影響，據報道烘烤會提高Amhl的含量，且使IgE抗體結合表位更易與抗體結合。雖然花生與豆科植物有交叉反應蛋白，臨床交叉反應卻不多見。花生過敏多見于對蛋、奶、核桃等過敏的個體，但并未發現其與核桃有交叉反應性蛋白。多數情況下，花生過敏終生存在且可惡化。近年來，免疫電泳、ELISA、PCR、生物傳感器等多種技術被應用于食物過敏原的研究，使人們對食物過敏原的認識有了很大進步，但食物過敏原的交叉反應性，不同處理過程對其過敏原性的影響以及轉基因食物的過敏原性等問題還須進一步探索。

綜上所述，近年來，食物過敏的發病率有上升的趨勢，而過敏原的檢測對疾病的預防、治療意義重大。隨著免疫學的發展，食物過敏原的檢測技術有了很大的進步，但也存在著不足：(1)因食物過敏原為(糖)蛋白，這類(糖)蛋白有些穩定，有些不穩定，使試驗的敏感性受到限制；(2)一些堅果類食物、海鮮存在交叉反應，故食物過敏原檢測特異性不是很強口；今后還有待進一步改善。檢測食物性過敏原的還有血IGG檢測，組胺釋放試驗，嗜堿性粒細胞活化試驗等方法，沒有哪種方法能檢測出所有的食物過敏原，故臨床實踐中應注意聯合應用。

分子生物學與免疫學的發展使人們對食物過敏原的結構、免疫原性等有了進一步的認識，而生物信息學的發展為過敏原的研究提供了強有力的支持，在分析過敏原結構，識別T淋巴細胞與B淋巴細胞表位，評估過敏原性與交叉反應性等方面與傳統實驗室技術互補。現在國外已有一些網站可以評估食物蛋白的交叉反應性，并可根據轉基因食物的基因序列來評估其過敏原性。相信在不久的將來，人類會對食物過敏原有更深刻的認識，這為今后食物過敏機制的研究、過敏原檢測試劑的研發都提供了很好的平臺。

省略了原文中的表格及圖（照）片，如對本文感興趣，請參閱中華檢驗醫學雜志2007年第30卷第8期。