學習目的：
1、學習有關肝素的分子結構
2、懂得肝素如何防止血液凝固
3、知道肝素的不同制備模式及其治療應用
4、熟悉肝素怎樣被標準化
5、認識圍繞肝素作為體外血氣分析抗凝劑應用中的爭論問題
6、比較血氣分析中液體肝素和凍干肝素兩者的優缺點
7、知道肝素作為抗凝劑在檢測離子鈣時可能發生的兩類錯誤
8、評估肝素鋅—鋰使用的合理性
臨床實驗室檢查分析前期所進行的良好操作實踐非常重要。對臨床有用的高質量正確結果的產生大多取決于患者樣品到達實驗室前這一段過程，它與在實驗室內進行分析過程同等重要。目前很少有像血氣分析這樣的檢測能證明分析前期的良好操作實踐的重要性。不嚴格遵守血液收集、處理程序和及時運送樣品等規范就可能導致血氣檢測結果的無效。本文闡述了血氣分析前的一個過程，即肝素抗凝血樣品的使用。重點關注的是由于需要加肝素至血中而引起的血氣分析儀參數檢測過程中的潛在錯誤的發生以及怎樣避免或至少減少錯誤的發生。本文首先就肝素本身做一概述。
肝素概述
肝素是存在于所有哺乳類動物體內的一種天然抗凝劑，因1916年首次從肝組織中分離出而得名。它由肥大細胞和啫堿粒細胞合成，并貯存于這些細胞的分泌顆粒中。由于肥大細胞存在于多種組織類型中，因而肝素可以來自于大量肝外組織，其商品化制劑目前絕大多數來自于豬腸粘膜。
結構
肝素屬于糖復合體家族，通稱糖胺聚糖（或粘多糖）。本質上糖胺聚糖是重復二糖單元的長非分支鏈，各包括一個N-2酰基氨基己糖的一個己糖或己糖醛酸。在這一總的格式內，可能有很多不同的二糖亞單位，它們以多樣性序列加入到一系列鏈的長度中。這些多樣性說明糖胺聚糖作為一個如肝素這樣的家族和家族成員顯示出了很大的分子異質性。肝素是一個鏈的組成和鏈的長度均呈異質性的“混合物”，因而其分子量可以從3KDa——30KDa（平均約15
KDa）。肝素區別于其它糖胺聚糖的一個特征是它含有一個非常高比例的二糖硫酸鹽單元。肝素分子內有一種特別獨特的高硫酸鹽的五糖序列存在，其比例占30%，是肝素具有抗凝效果的原因。
抗凝作用和治療作用
肝素能防止血液凝固是因為其具有獨特的五糖序列結構，可以牢固地結合抗凝血酶Ⅲ。抗凝血酶Ⅲ是一種血漿蛋白，通過結合包括Ⅺa、Ⅹa、Ⅸa和Ⅱa（凝血酶）在內的一些活化的凝血因子來抑制這些凝血因子的酶作用，從而起到抑制血液凝固的作用。抗凝血酶Ⅲ的生理學功能在于阻止體內血液的凝固，因而可以維持完整血管內血液的流動性。肝素結合的效應是將抗凝血酶Ⅲ的活性增加了1000倍以上，因此能有效防止血液凝固形成所必需的纖維蛋白形成過程。肝素的抗凝效應可以在體外和體內都發生。
20世紀30年代后，通過體內注射肝素以達到人為降低血液凝固性的做法已被用于治療目的。由于肝素不能被胃腸道吸收，因而必須通過靜脈或皮下注射方式進行。雖然存在著這些限制，肝素仍然是應用最廣泛的一種抗血栓藥，主要用于治療和預防靜脈栓塞和肺梗塞。傳統上應用的是未分段的肝素（UFH）鈉鹽，其一度被作為是唯一可用的形式。近年來平均分子量范圍在3KDa-5
KDa的更精制的低分子量肝素已取代UFH作為很多臨床用藥的選擇，因為這些新的制劑不良副反應更少。最近的進展是根據模擬關鍵的抗凝血酶Ⅲ結合五糖序列所開發的一類合成肝素藥物，其中Fondaparinux（Atrixia）是這類“合成肝素”藥物中效果最好的一種。
肝素的標準化——肝素鹽類
肝素活性（濃度）的測定采用的是WHO的國際單位（IU）或美國藥典（USP）單位。定義USP單位依據的是加入0.2ml1%CaCl2溶液后阻止1ml枸椽酸羊血漿在1小時內凝固所需的肝素量。這一劑量的肝素是0.005mg。IU和USP單位之間存在著小（7%—10%）的差異，目前的趨勢是協調二者。肝素鈉是天然產生的肝素鹽，主要為藥用和供實驗室使用。肝素鋰專用于實驗室作為體外抗凝劑使用，它通過陽離子交換色譜從肝素鈉中制備。
肝素的體外應用和血氣分析
在實驗室用于生化分析血液樣品的準備中采用肝素的體外抗凝作用已有50年以上的歷史。生化分析大多采用的是靜脈血液離心后的液體（非細胞）部分。抗凝可立即分離液體部分（血漿），而不加抗凝劑時要等待1小時或更多時間直至血塊收縮時才能分離出液體部分（血清）。大多數以血漿為樣品進行的生化分析推薦的抗凝劑是肝素鋰，其終濃度為每毫升血液加10-30USP單位。目前公認的是過量肝素可有效抗凝。幾十年的經驗表明加入這一濃度的肝素對大多數常見血液分析并無影響（即與血清比較無顯著差異）。
有些血液試驗只能在均質全血樣品中進行。它們包括pH、pCO2和pO2等由血氣分析儀所測定的傳統參數，均需要抗凝的血液樣品（除非在體外凝固前1-2分鐘內分析）。肝素是血氣分析試驗所選擇的一種主要抗凝劑。抗凝是完全必要的，因為它不僅僅是為了得到為保證正確結果而需要的均質樣品，同時也是為了避免微小的血栓（肉眼不一定可見）堵塞血氣分析儀的樣品通路。
由于現代血氣分析儀檢測項目的增加以及與肝素應用有關的新問題的出現，因而圍繞肝素應用的問題采用歷史學觀點是有用的。起初的血氣分析儀檢測項目僅限于血氣（pCO2、pO2）和pH測定，并且血氣分析樣品通常采用肝素鈉溶液進行抗凝。
早期年代——應用液體肝素鈉溶液
1960年，Siggaard-Andersen確定只要肝素的濃度在血液中低于1mg/ml（約200IU/ml血液），則其對測定酸堿參數（pH和pCO2）就無影響。超過這一肝素濃度則pH會下降0.003單位，而pCO2上升0.1mmHg（0.013kPa）。由于達到抗凝效果的肝素濃度遠小于1mg/ml，因而溶液中的肝素很容易與血液進行混和，因而肝素鈉（后采用肝素鋰）溶液（1000IU/ml）被用來作為制備檢測pH、pCO2和pO2抗凝血液的傳統方法。只需將0.2ml（1000IU/ml）的肝素鈉（鋰）加至5ml血液中使其最終濃度達到40IU/ml，就能達到完全抗凝效果。
液體肝素的主要缺點是如果血液被肝素溶液過度稀釋就有發生潛在錯誤的可能。發生這一潛在錯誤的可能在于液體肝素中的pH、pCO2和pO2與動脈血中的相比有著相當多的差異。肝素溶液的大致數值為pH6.4、pCO2
7.5mmHG（1KPa）、pO2
160mmHG（21KPa），顯示肝素在與空氣平衡時是酸性溶液。目前已有一些研究對增加肝素稀釋樣品后對血pH、pCO2和pO2測定的影響進行了調查。
簡言之，這些研究調查表明pH的測定能抵抗這種稀釋的影響。即使肝素與血液等量混和（即血液稀釋50%），pH仍可保持恒定，這很可能是由于血液的緩沖能力所致。pCO2對稀釋的影響也具有相對的抵抗力。有些研究觀察到稀釋對pO2無影響，而另一些則報道在高度稀釋（35%-50%）時可見pO2增加。pCO2是最敏感的參數，在稀釋比例＜10%（例如將0.5ml肝素加至5.0ml血液）的時候，pCO2無顯著變化；但當稀釋比例＞10%時則pCO2值會顯著減低。有一份報道的結果很有代表性，它表明如果血液pCO2為51mmHG（6.8KPa）時分別用肝素作10%-20%和40%的稀釋，則pCO2可分別減至44mmHG（5.9
KPa）、39mmHG（5.2 KPa）和31mmHG（4.1
KPa）。稀釋每增加1%時pCO2約減少1%。計算來自于pCO2測定的酸堿參數、碳酸氫鹽和堿剩余時會受到相同的影響。
需要強調的是上述稀釋效應并非由于肝素本身所致，而是源于所加入到血液中的液體。例如即使將鹽溶液加入到血液中去也會出現同樣效應。
為避免在進行pCO2和pO2檢測時因應用液體肝素而導致的潛在稀釋錯誤的發生，很重要的一點是肝素的容量應＜10%，最好為總樣品量的5%或更少。這一比例可以通過用肝素濕潤注射器內壁和注射器中心的死腔來達到。標準2.0ml注射器的死腔容量約為0.1ml，0.1ml的肝素（1000IU/ml）置于2.0ml血中后其最終稀釋比例為5%，也就是說肝素最后的濃度為每毫升血中50IU。
如果樣品被收集于含凍干（干燥）肝素的注射器內，就可完全清除在pCO2和pO2測定過程中因不正確應用液體肝素鈉（或鋰）所導致的錯誤危險。凍干肝素的缺點是不易與血液相混和，除非增加肝素濃度，否則就有理論上出現抗凝作用不完全的危險。不過在一項對比研究中發現，相同濃度的干粉與液狀肝素鈉（33IU/ml血液）兩者在pH、pCO2和pO2的測定上并無差異，應用肝素干粉未遇到發生凝固的情景。
擴展試驗引發新的挑戰
在臨床要求驅動下的技術進展已使得血氣分析儀能用檢測pH、pCO2和pO2的同一份動脈血樣品來測定一些附加的生化分析（如鈉、鉀、離子鈣、膽紅質、葡萄糖）。但重要的是要保證肝素抗凝的血氣樣品不僅不能干擾pH、pCO2和pO2的測定，而且也不能干擾這些附加分析物的測定。電解質測定特別是離子鈣測定會產生一個特殊問題，這是因為傳統用于pH、pCO2和pO2測定的抗凝血液的肝素制備物會在測定離子鈣時出現明顯的錯誤。
肝素和離子鈣
應用肝素抗凝測離子鈣可引起兩類錯誤，首先是由于應用傳統液體肝素所造成的簡單的稀釋錯誤。應用肝素稀釋血液測離子鈣時，其負面偏差直接與肝素稀釋血液有關，發生率可高達5%。這一錯誤從理論上講可在某種程度上適用于所有分析物，要減少它的發生就需要盡可能減少肝素與血液樣品容量的比例。合適的比例是將21μl肝素與2ml血液（即1%稀釋）進行混和，這要通過嚴格細心的操作來達到。在離子鈣測定中采用這種稀釋比例時所出現的偏差臨床上幾乎難以察覺。一種更安全的方法（保證沒有稀釋錯誤）是應用干燥（凍干）肝素。目前臨床和實驗室標準協會（CLSI）推薦的就是這一種方法。
第二種可能的錯誤來自肝素的鈣結合特性。肝素鈉（鋰）與鈣結合后可以人為地減少離子鈣濃度，其減少的量與肝素濃度成正比。例如15IU/ml肝素鋰可引起離子鈣減少約0.03mmol/L。肝素濃度為50IU/ml時其離子鈣可減少0.15mmol/L，肝素濃度在100IU/ml時其離子鈣可減少0.19mmol/L。
可以通過采用兩種基本對策中的一種來防止肝素鋰與鈣的結合：
* 降低傳統的肝素鋰濃度；
* 放棄傳統的肝素鋰，采用新的肝素產品（鈣平衡肝素、肝素鋅和混和的肝素鋅/鋰）。
為減少因肝素結合所引起的離子鈣的負面偏差，肝素鋰濃度必須＜10IU/ml。但有些專家警告“盡管10IU/ml肝素可明顯減少肝素的副反應，但預計這一低濃度不能消除所有分析儀中的凝固過程。我們已注意到有些血液樣品甚至在肝素濃度高達150IU/ml時還不能抗凝”。與低濃度肝素相關的潛在抗凝問題催生了新技術的產生，即在有惰性填料的“抽吸器（puff）”內制備肝素鋰干粉，使其混合后很容易分散至血中。這項技術已被用于商品化的血氣樣品儀中，使肝素鋰的濃度正好為2.8IU/ml。這一方法在一些試驗中已被證實與不加抗凝劑的血液相比，在檢測電解質（包括離子鈣）方面無差異。
鈣（電解質）平衡肝素是肝素鋰和肝素鈉的混和物，其中加入的氯化鈉，最后的離子鈣濃度是1.25mmol/L，處于健康成人離子鈣的中位點范圍。這一新的肝素制備產物在鈣濃度為1.25mmol/L時可以消除鈣結合的影響，但當濃度偏離1.25mmol/L時可發生輕度（臨床不明顯）偏差。如濃度＜1.25mmol/L為正偏差，如＞1.25mmol/L則為負偏差。因此，如果真正的離子鈣濃度為0.75mmol/L，則此濃度偏差為+3%，測定的離子鈣濃度應是0.77mmol/L；相反，如果真正的離子鈣濃度是2.5mmol/L，則偏差為-2%，測定的離子鈣濃度就是2.45mmol/L。約90%-95%離子鈣測定結果在0.9mmol/L-1.8mmol/L范圍內，在此范圍內所有結果的偏差＜2%，臨床可以接受。該方法的優點是所用肝素濃度相對可高一些（70IU/ml），這樣可大大減少因抗凝不足所帶來的危險。一些研究已經證實鈣（電解度）平衡肝素可以有效地用于血氣分析物上的所有分析物測定。加入含鈣抗凝劑至樣品內的做法不適合在實驗室進行總鈣測定。
肝素鋅應用的基本原理是鋅占有正常鈣結合的肝素位點，這樣可有效地減少肝素與鈣的結合，并因而減少與離子鈣測定有關的錯誤。事實上，肝素鋅可輕度增加離子鈣濃度。因為肝素鋰減少的離子鈣與肝素鋅增加的離子鈣等量，兩者1：1混和后在健康人群和患者范圍內可消除離子鈣結果的偏差，對包括總鈣在內的其他分析物均無影響。一些研究證實對血氣分析來講，肝素鋅一鋰的混合應用可以作為合適的抗凝劑使用。
總結
肝素是血氣分析樣品制備中所使用的唯一抗凝劑。兩種情況下肝素的使用會干擾檢測結果。首先是血中具有高濃度的肝素，其次是用液體肝素而不是肝素干粉（凍干）會稀釋血液樣品。在目前的血氣分析儀上，傳統的血氣分析項目（pH、pCO2、pO2）的檢測要比電解質（特別是離子鈣）受肝素的影響小。如果樣品僅需要測定pH、pCO2和pO2
，那么對這些分析物來說，肝素（鈉或鋰）濃度＜200IU/ml、血液稀釋不超過5%仍是必不可少的。電解物測定應當采用的是肝素鋰而不是肝素鈉。離子鈣測定要求采用的肝素是凍干品，其濃度不超過10IU/ml。
不論肝素怎樣制備，要得到準確的結果就需要有準確量的血樣品和準確的肝素濃度（如用液體肝素稀釋），樣品采集后血液和抗凝劑應立即充分混和。血氣分析最常見的一個實際問題是抗凝不適當，導致小量血塊形成并阻塞血氣分析儀的樣品通道使結果不準確。顯而易見的是，肝素濃度越低危險性就越大，混合技術不好可造成抗凝不合適及其它相關問題。
參考文獻（略）