1．實時熒光定量PCR無需內標實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
2．內標對實時熒光定量PCR的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。
美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內標法定量的方法學比較，得出的結論是：內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方。
AppliedBiosystems公司的7700型實時熒光定量pcr儀是全球公認的熒光定量PCR的金標準，可實現多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標準曲線的方法，而不用內標進行定量。
綜上所述，利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。
熒光PCR是分子診斷的熱點技術，它將先進的定量PCR與實時PCR技術相結合，西安天隆生產的國產實時熒光定量PCR儀為肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸檢測及分子診斷、同時也為沙門氏菌阪崎氏腸桿菌等食品安全檢測提供了先進手段。即使在發達國家，熒光定量PCR儀和基因擴增儀都被廣泛用于臨床及生物學、醫學研究。由于其極高的靈敏度、極寬的檢測范圍，以及精確定量、方便快速、無窗口期等優點，美國FDA及我國國家標準已將定量PCR儀規定為確診禽流感等傳染病以及奶粉等食品安全檢測的必備儀器。
實時熒光定量PCR儀（real-timeQPCR）的發明實現了榮獲諾貝爾化學獎的PCR核酸檢測、分子診斷的技術飛躍。