腸球菌的耐藥特點及藥敏試驗方法

腸球菌是臨床較常見的一類。據近些年的報道，腸球菌已成為醫院感染中重要的病原菌，危害性越來越大。腸球菌往往對抗生素耐藥或高度耐藥，能否準確檢出耐藥菌株對抗感染治療的成敗十分重要。針對腸球菌的藥敏試驗方法，國外進行了相當多的研究，確定了一整套科學的方案。以下將有關問題作簡要介紹。

　　一、臨床常見的腸球菌

　　腸球菌原屬鏈球菌屬，自1984年獨立新菌屬以來，至今起碼有19個菌種^［1，2］。1990年Ruoff等^［3］研究了臨床標本中腸球菌的分布特點，分離到8個菌種，糞腸球菌和屎腸球菌占絕大多數，見表1。還有鳥腸球菌(0.3%)、堅腸球菌(0.3%)、母雞腸球菌(1%)、酪黃腸球菌(1%)、空腸腸球菌(0.3%)和棉子糖腸球菌(0.3%)。1992年馬俊春^［4］也做了相似報道。

表1　腸球菌在臨床標本中的分離率(%)

　　各種腸球菌的分布狀態因抗生素的使用發生變化。以萬古霉素作為治療感染的首選藥物，造成萬古霉素耐藥菌種的增加。Boyle等^［5］觀察到1990～1992年3年間屎腸球菌逐年遞增，分離率分別為10.9%(1990年)、26.0%(1991年)、34.0%(1992年)。

　　二、腸球菌的耐藥特點

　　腸球菌的耐藥特點主要表現在青霉素、氨基糖甙類藥和萬古霉素^［6］。對青霉素敏感的菌株最低抑菌濃度(MIC)＜8μg/ml， 如MIC＞16 μg/ml，定義為耐藥。多數菌株對青霉素耐藥系產生了β-內酰胺酶。有部分不產生β-內酰胺酶，但MIC＞128　μg/ml，是由于產生過量的慢反應青霉素結合蛋白(PRS)。對這種高度耐藥的菌株， 青霉素與氨基糖類聯合用藥也無作用^［7］。

　　一些腸球菌株對氨基糖甙類藥物表現高度耐藥，MIC＞2 000μg/ml。這一現象稱氨基糖甙類高水平耐藥(HLAR)。HLAR是因細菌產生了多種氨基糖類修飾酶(AME)。一種AME可起到對多種氨基糖類藥物耐藥的作用。一株細菌可以同時產生幾種AME，表現出多重耐藥。HLAR菌株僅對萬古霉素敏感。屎腸球菌的AME基因位于染色質上；其他腸球菌的則位于質粒上，并且能夠在不同菌種間傳播耐藥性。

　　腸球菌對萬古霉素耐藥初見于1988年，已確認有3種程度不同的耐藥，分別由Van A、Van B和Van C3種耐藥基因決定。Van A位于染色質上，Van B和 Van C由質粒攜帶。Van A和Van B菌株的耐藥程度高。Van C為低水平耐藥。各種腸球菌的萬古霉素耐藥特點見表2^［8］。

表2　各種腸球菌的萬古霉素耐藥特點

　　另有個別需萬古霉素才生長的腸球菌，Fraimow等^［9］1994年報道了一株這樣的菌株。該菌株從長期使用萬古霉素治療的泌尿系感染患者的尿液中分離出來。

　　三、腸球菌感染的治療方法及藥敏試驗選藥方案

　　根據腸球菌的耐藥特點， 抗感染治療分為3種情況。青霉素或氨芐西林的MIC在2～8μg/ml之間的糞腸球菌，單獨用青霉素或氨芐西林治療。較耐藥的屎腸球菌，青霉素的MIC在8～32μg/ml之間，以青霉素和一種氨基糖類藥物聯合使用進行治療。

　　HLAR菌株，青霉素和氨基糖苷類藥物聯合治療無效，須使用萬古霉素。對萬古霉素耐藥的菌株，治療比較困難，沒有特定的規律，可供選擇的有四環素、氯霉素、喹諾酮類，泌尿系可考慮呋喃妥因或磺胺類。

　　做藥敏試驗選擇藥物時，須符合腸球菌的耐藥特點，美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)藥敏試驗操作標準要求只做青霉素或氨芐西林(A組)，萬古霉素(B組)和慶大霉素(C組)。泌尿系感染做喹諾酮類和呋喃妥因^［10］。

　　非泌尿系分離的腸球菌，A組為首選，兩種藥物做一種就可代表所有青霉素類藥物的敏感性，包括苯咪唑西林，洛美霉素和氧哌嗪西林。青霉素藥敏試驗結果如為“中度敏感”，提示治療應采用聯合用藥，一種青霉素加一種氨基糖類藥。A組耐藥，測萬古霉素，耐藥時須用慶大霉素或鏈霉素確定是否為HALR。當藥敏試驗結果A組藥物敏感，即便已經做了B和C組藥物的試驗， 結果也不應報告臨床。病人如果對青霉素過敏，報告萬古霉素的結果。

⁵ cFU/ml。過夜培養混濁為HLAR。

　　稀釋法篩選試驗須用BHI。Swenson等^［2］的研究認為，腸球菌在MH瓊脂上生長較差，結果不宜判定，用BHI結果很清楚，且重復性很好。不能使用加血液的MH培養基，否則抑菌環偏大或假耐藥。

　　3.萬古霉素篩選試驗：腸球菌對萬古霉素的耐藥率增加驚人。有報道，1989～1993年，耐藥率由0.3％增至7.9%。不僅如此，因常用的自動化儀器和紙片法試驗會漏檢一些低水平耐藥菌株，耐藥率還會更高。Tenover等^［8］評價了10種試驗方法，認為傳統的紙片法和幾乎所有儀器方法、微量板方法均有程度不同的誤差，有的極重要誤差高達16％。常量的肉湯或瓊脂平板藥敏試驗方法， 結果可靠。較為標準的萬古霉素篩選試驗方法如下^［12］。(1)條件： 培養基：BHI；藥物濃度：萬古霉素6 μg/ml；接種菌量：10⁵～10⁶ CFU/接種點；觀察時間：18小時初步看結果，24小時讀取最終結果。(2)操作：制備含萬古霉素6 μg/ml 的BHI平板、備用。待測菌株制成菌懸液，濁度為0.5麥氏管。取菌懸液10μl點種在瓊脂平板上，35℃培養過夜，約18小時初步觀察結果，接種點有細菌生長，報告耐藥。未見細菌生長，繼續培養至24小時，仍未生長者報告敏感，生長者報告耐藥。

　　使用篩選法，可以檢出MIC在4～8 μg/ml之間的低水平耐藥菌株，如酪黃腸球菌和母雞腸球菌。

　　五、

　　紙片法和稀釋法藥敏試驗，采用敏感的菌株作為質量控制菌株，NCCLS指定用ATCC29212(或ATCC33186)^［10］。

　　對于篩選試驗， 目的是檢出耐藥細菌， 耐藥為正結果。實驗中， 除了敏感菌株外，還須用耐藥菌株作為陽性對照， 進行質量控制。Swenson等^［13］建議用ATCC51299作為耐藥的菌株。該菌株具有萬古霉素耐藥基因Van B，慶大霉素耐藥基因 acc(6′)+aph(2′′)和鏈霉素耐藥基因 ant(6)-I。藥敏試驗結果：萬古霉素 mIC，培養24小時為16～32 μg/ml、培養48小時為 128 μg/ml；慶大霉素和鏈霉素MIC均 ＞2 000 μg/ml。ATCC29213和ATCC51299的質量控制標準見表4。

表4　篩選試驗的質量控制方法及標準