培養陽性結果的處理: 傳統手工法血培養應該每天至少檢查一次,對48h~72h未生長的培養瓶至少應進行需氧傳種培養一次。對培養瓶進行肉眼檢查,注意下列幾點提示有生長:
1. 血與肉湯混合物出現渾濁。
2. 在層上有絮狀沉淀,某些鏈球菌在沉積的紅細胞表面上,會有小的“棉球樣”生長。
3. 肉湯內出現混濁生長 。
4. 肉湯表面有薄膜生長。
5. 出現溶血。
6. 產生氣體,許多發酵菌可產氣,梭菌屬會產生大量的氣體,出現明顯的溶血現象。
7. 血液層表面或深層有白色顆粒。
8. 液體培養基凝固。
如果懷疑血培養陽性,應立即進行革蘭染色,以無菌手續從培養瓶中取肉湯2~3滴涂片,自然干燥,加熱固定并染色。染色結果應盡快報告,如革蘭陽性球菌為成對或成堆或成鏈,革蘭陰性桿菌為小桿菌或球桿菌等。革蘭染色結果可指導醫生為患者經驗選擇抗生素治療, 并作為進行鑒定補充試驗的參考依據,它對于鑒別葡萄球菌和鏈球菌非常有用。如果血培養陽性革蘭染色未發現細菌,應做丫啶橙染色進行二次鏡檢,這對檢測彎曲菌菌血癥和布魯菌菌血癥很有幫助,而革蘭染色很少發現這些細菌。依據細菌革蘭染色形態特點, 選擇適當的培養基傳種, 見表3。
表3. 血培養陽性后根據革蘭染色特點應傳種培養基種類的建議
5~10%CO2孵育a 厭氧氣體孵育a
染色特點 中國蘭或
血瓊脂 巧克力瓊脂 麥康凱或EMB 血瓊脂 PEA或CAN
革蘭陽性
球菌 X X X
桿菌 X X X
革蘭陰性
球菌 X X X X
桿菌 X X X X X
真菌b X X
持續監測陽性, X X X
革蘭染色陰性c
a 所有培養至少至48h;EMB: 伊紅美藍瓊脂;PEA:苯乙基醇瓊脂;CAN: 多粘菌素-萘啶酮酸瓊脂。
b 增加真菌培養基(如:沙保弱葡萄糖瓊脂)和30oC培養,c 接種硫羥乙酸鹽肉湯中。
當革蘭染色顯示細菌形態均一時,厭氧培養的價值不大。對所有培養陽性,革蘭染色陰性的血培養瓶, 再次上機監測之前都應傳種厭氧和需氧培養皿。
革蘭染色為純的細菌,可進行初步鑒定并做直接抗生素藥敏試驗。對陽性血液肉湯培養物,還沒有細菌鑒定或直接抗生素藥敏試驗的標準程序,而且沒有經FDA批準的市售產品。可用于初步鑒定的商品試劑, 包括:膽汁溶解,DNA酶,乳膠凝集分型試驗等。
美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦的抗生素敏感試驗沒有血培養直接敏感試驗法。然而,許多學者提出:根據革蘭染色初步分析鑒定,可以靈活地選擇抗生素進行直接抗生素藥敏試驗。
對各種血培養法中的陽性肉湯培養物進行傳種并且立即孵育培養, 為進一步試驗用,傳種5h~7h后有明顯的菌落生長,取瓊脂表面的菌落用于細菌鑒定和抗生素敏感試驗。使用含固體培養基的血培養系統,如:雙相法,有菌落生長可直接進行細菌鑒定和標準的抗生素敏感試驗。
盡管現在使用探針雜交和DNA擴增技術可以鑒定血培養中的細菌和檢測抗生素敏感性,但這種技術不實用,價格昂貴,FDA不推薦常規使用。
血培養分離的細菌,以防需要進一步的研究,至少保存幾個星期。為了讓細菌活著,兼性需氧菌和兼性厭氧菌應傳種到半固體培養基中,例如動力培養基。嚴格厭氧菌應保存到無葡萄糖的肉湯培養基或冷凍在兔血或脫脂牛奶培養基中。苛養菌可以接種到巧克力瓊脂斜面上并用礦物油封存。為長期儲存,細菌可懸浮于15%甘油肉湯中并-70oC冷凍。
血培養陽性結果的報告程序:血培養陽性結果十分重要,應立即口頭報告給患者的主治醫生,報告的日期和時間以及接受報告人的姓名應記錄在患者的報告單上。應向臨床醫師提供重要的信息,包括革蘭染色的形態,血培養陽性的數量和其它的鑒定資料,如革蘭陽性球菌可疑為葡萄球菌。處理報告之前,應回顧一下患者近期標本的培養情況,這些結果有助于解釋感染微生物來源。口頭報告后應立即進行書面初步報告。除非初步報告有錯誤或新發現可改變患者的治療方案, 否則不應更改初步報告的結果。
當培養24h和48h后, 對陰性血培養結果在最短的時間內發出初步報告。 有些實驗室以培養的時間長短發初步報告,例如: “血培養3天后無細菌生長” 。
b-溶血鏈球菌生長也會有溶血現象;6. 嚴格需氧菌,如銅綠假單胞菌和酵母菌,在肉湯與空氣分界面生長旺盛,肉湯表面形成菌膜層; 7. 革蘭陽性芽胞桿菌屬或真菌將導致溶血性肉湯及在肉湯表面有清楚的小薄膜形成。對手工血培養系統,掌握這些微生物生長可視信號尤為重要,一旦出現生長信號,立即革蘭染色檢查微生物的存在情況。做直接的非標準的抗生素敏感試驗,能節約寶貴的時間,方法將一無菌拭子浸入混濁的肉湯液,擠出過多的液體,參照標準方法涂布Muller-Hinton瓊脂,根據革蘭染色特性,選擇適當的抗生素紙片,培養6h~8h后,經常觀察直接藥敏,若有藥敏結果及時報告,約95%的直接藥敏結果與標準藥敏結果一致。
如何提高血培養陽性率的操作規范
采血指征:對入院的危重患者未進行系統性抗生素治療時,應及時進行血液培養,患者出現以下體癥時可作為采集血培養的重要指征: 1. 發熱(338°C)或低溫(£36°C)。 2. 寒戰。 3. 白細胞增多(計數大于10,000′109/L,特別有“核左移”未成熟的或帶狀的白細胞)。 4. 粒細胞減少(成熟的多核白細胞小于1000′109/L)。 5. 血小板減少。 6. 皮膚粘膜出血。 7. 昏迷。 8. 多器官衰竭。 或同時具備上述幾種體癥時應采血培養。在評估可疑新生兒敗血癥時,除發熱或低燒外,很少培養出細菌, 應該補充尿液和腦脊液培養。肺炎鏈球菌與流感嗜血桿菌菌血癥的患兒(特別是2歲或以下的幼兒)一般出現于門診,常伴有明顯發熱(338.5°C)和白細胞增多(總數320,000x109/L)。老年菌血癥患者,可能不發熱或不低熱,如伴有身體不適,肌痛或中風可能是感染性心內膜炎的重要信號。
采血量: 對從菌血癥或真菌菌血癥患者血培養中獲得微生物, 每個培養瓶抽取的血量是唯一重要的變量。當培養的血量從2ml增加到20ml時,血培養的陽性率增加30%~50%,因為培養的血液量增加 1ml, 陽性率增加3%~5%。 用靜脈穿刺獲得的血量,成人和兒童不同。兒童,特別是新生兒很難獲得大量的血液,對嬰幼兒和兒童,一般靜脈采血1ml~5ml用于血培養,當細菌濃度足夠高時,血液少于1ml也足以檢測出菌血癥。標本量大于1ml, 細菌量也增加,對于感染的兒童每毫升血液比成人有更多的微生物。 對于成人血培養的標本量10ml,血液和肉湯的比一般推薦為1:5至1:10。幾乎所有現代的血培養系統每瓶加入血液量均為10ml。雖然靜脈采血30ml可增加細菌量,但這不太切合實際,這很容易造成醫院獲得性貧血。 血液和肉湯的比例(稀釋因子):血液和肉湯比一般為1:5至1:10(體積:體積)。人體血液中包含有各種抑制細菌生長因子,血液加入到肉湯中,稀釋的血液可能減少了這些因子亞抑制細菌生長的水平。另外,由于肉湯稀釋了血液,存在于患者血液中的抗生素也會稀釋到亞抑制濃度。血液和肉湯的比小于1:5可能會抑制細菌生長,所以血培養瓶也不應注入過多的血液。 血培養的數量和采血時間:血培養的數量和采血時間關系到菌血癥的病理生理學,一次靜脈采血注入到多個培養瓶中應視為單份血培養。研究已經證實,采集適量的血液,2~3份血培養足以檢測所有的菌血癥和真菌菌血癥。對間歇性菌血癥,用于培養的血液應在估計寒戰或體溫高峰到來之前采集,因為細菌流入血流與寒戰發作通常間隔1h,在發燒時血液可能沒有細菌,實際上,血培養通常是在寒戰或發燒后進行。由于細菌很快會從血流中清除,因此,在寒戰或發燒后應盡快抽取血培養。正是由于這個原因,我們一般不推薦在任意時間抽取靜脈血進行培養,研究資料表明任意時間采血并不能提高微生物的檢出率。實際上已經證明在24h內同一時間或任意時間抽血培養發現微生物的結果相似。無論何時,采集血培養應該在使用抗生素之前進行,推薦同時采集2~3份, 保證血液和肉湯比一般為1:5至1:10進行培養來做最初的評估, 這也更切合實際。用過抗生素治療可能導致血培養結果陰性,微生物延遲生長更為常見。
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有研究證實,對鏈球菌心內膜炎患者,做血培養的前兩周內患者接受了抗生素治療,血培養的陽性率從97%下降到91%。由于有很好的血培養技術,對感染性心內膜炎患者血培養的陽性率應該達到95%以上。
對特殊的全身性和局部感染患者采集血培養的建議:
1.懷疑急性原發性菌血癥、真菌菌血癥、腦膜炎、骨髓炎、關節炎或肺炎的患者 :應立即采集2或3份血培養,快速進行血培養。
2.不明病源的發熱,如隱性膿腫,傷寒熱和波浪熱:首先采集2或3份血培養。24h至36 h后,估計體溫升高之前(通常在下午)立即采集2份以上血培養。
3.懷疑菌血癥或真菌菌血癥,血培養結果持續陰性:應改變血培養方法,以便獲得罕見的或苛養的微生物。
4.感染性心內膜炎: 對急性心內膜炎患者1h~2h內采集3份血培養, 如果所有結果24h后陰性,再采集3份以上的血培養。入院前兩周內接受抗生素治療的患者,連續三天采集血培養,每天2份。