檢測細胞凋亡的實驗方法比較

　　◆ TUNEL 與 ELISA 檢測凋亡的方法比較

　　TUNEL法

　　細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用.

　　ELISA法測細胞凋亡

　　細胞凋亡時，Ca2+,Mg2+離子依賴的內源性核酸內切酶將雙鏈DNA從各核小體間連接區裂斷，產生單或寡合苷酸小體，各核小體的DNA與核組蛋白H2A,H2B,H3,H4形成緊密的復合物而對內源性核酸酶有抵抗使之不被內源性核酸酶裂解。主要使用單克隆抗DNA抗體和抗組蛋白抗體直接檢測DNA和組蛋白。

　　◆ 幾種檢測凋亡的方法

　　一、形態學觀察方法

　　1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有“出芽”現象。

　　2、丫啶橙（AO)染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

　　3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。

　　4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。

　　二、DNA凝膠電泳

　　（一）、檢測原理

　　細胞發生凋亡或壞死，其細胞DNA均發生斷裂，細胞內小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質內出現DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規律的發生在核小體之間，出現180－200bpDNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細胞的死亡，并可與壞死細胞區別。

　　（二）結果判斷

　　正常活細胞DNA 電泳出現階梯狀（LADDER)條帶；壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續性條帶。

　　三、酶聯免疫吸附法（ELISA)核小體測定

　　凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。

　　（一）檢測步驟

　　1、將凋亡細胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體；

　　2、在微定量板上吸附組蛋白體’

　　3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合‘

　　4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合’

　　4、加酶的底物，測光吸收制。

　　（二）用途

　　該法敏感性高，可檢測5*100/ml個凋亡細胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測定凋亡細胞發生的絕多對量。

　　四、流式細胞儀定量分析

　　（一）檢測原理

　　細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。

　　（二）應用價值

　　流式細胞儀檢測具有以下特點：

　　1)、檢測的細胞數量螅虼似浞從橙禾逑赴牡蟯鱟刺冉獻既?BR>2)、可以做許多相關性分析

　　3)、結合被檢測細胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞周期

　　■檢測形態學及細胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法

　　細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常細胞和壞死細胞之間，利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。

　　利用Hoechs-PI染色法，正常細胞對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取Hoecha染料，呈現強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙啶（PI)而呈強的紅色熒光。

　　■DNA片斷原位標記法

　　凋亡細胞DNA片斷原位末端檢測技術是指在細胞（或組織）結構保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT)相反應與凋亡細胞裂解后3·的羥基（－OH）端結合，經顯色反應后檢測DNA裂解點的技術。

　　DNA片段原位標記法有二種：

　　1、原位缺口轉移（in situ nick-translation,ISNT)技術，它是利用DNA多聚酶I將標記的核苷酸連接到斷裂DNA的3·－OH端

　　2、原位缺口末端標記技術（in situ end labelling technique,ISEL)，即TUNEL法，它是利用TdT將標記的DUPT接到3·-OH端。研究證明，TUNEL法的敏感性遠高于ISNT，尤其對早期凋亡的檢測，TUNEL更為合適。

　　■檢測細胞膜成分變化的Annexin V 聯合PI法

　　1、原理：在細胞凋亡早期位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（PS)遷移至細胞膜外測。磷脂結合蛋白V（Annexin V）是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白，它于PS具有高度的結合力。因此，Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂酰絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），同時結合使用PI拒染法（因壞死細胞PS亦暴露于細胞膜外測，且對PI高染）進行凋亡細胞雙染法后用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。

　　2、結果判斷：正常活細胞Annexin V 、PI均低染；凋亡細胞Annexin V高染、PI低染；壞死細胞Annexin V/PI均高染。

　　3、應用價值：細胞發生凋亡時，膜上的PS外露早于DNA斷裂發生，因此Annexin V聯合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又Annexin V聯合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯合PI法更加省時，結果更為可靠，是目前最為理想的檢測細胞凋亡的方法。

　　◆ 幾點參考

　　1.大部分凋亡細胞可能并不見得有非常典型的凋亡表型，如電鏡的染色體邊集、凋亡小體等，DNA電泳也不見得都有DNA ladder，但對某些指標來說還算穩定，如PI染色及TUNEL法，所以如果某個方法效果不好，可以換用其他方法檢測

　　2.壞死與凋亡的區分傳統上認為是無序與有序的過程，樓上所說的線粒體腫大也是以前的一個傳統認識，但現在有很多人認為壞死的發生也是有序發生的，因此也有了程序化壞死一說，在很大程度上，由于凋亡是時間依賴性的過程，細胞發生凋亡也并非同步化的，凋亡的晚期與壞死進行區分是困難的，而且我認為如果不是對于凋亡或是壞死本身通路進行研究的話，強行區分是沒有意義的

　　◆細胞凋亡檢測技術與方法

　　細胞凋亡（Apoptosis），又稱細胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death)，是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程。它是一個主動的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。細胞凋亡概念提出至今還不到30年的時間，但由于它在保證多細胞生物的健康生存過程中扮演著關鍵角色，對個體的正常發育及細胞凋亡紊亂在病理學研究中的重要作用，引起了人們對其機制和組分的廣泛而深入地研究，成為目前生命科學界最為熱門話題之一，也是生命科學界乃至社會各界爭相投入的研究領域。從近年的SCI排名中我們可以看到，信號傳導方面的文章遠遠超過位于第二位的人類基因組方面的，而信號傳導中一個重要的前沿領域就是細胞凋亡的研究。隨著這方面研究的持續升溫，涌現出了大量新的技術和方法對細胞凋亡進行檢測，其中不少已經有商品化的產品出現，大大加速了研究的進程。具體來說，針對凋亡的不同階段有以下一些方法（概括如圖1）：

　　1． 早期檢測:

　　1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測:

　　PS從細胞膜內側轉移到外側在細胞受到凋亡誘導后不久發生, 可能作為免疫系統的識別標志。AnnexinV，一個鈣依賴性的磷脂結合蛋白，能專一性的結合暴露在膜外側的PS，再通過簡單的顯色或發光系統進行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細胞檢測（懸浮細胞和貼壁細胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發展階段。

　　美國著名生物試劑公司CLONTECH和INTERGEN公司分別開發了多種標記的Annexin V產品，簡便快速，10分鐘就可完成檢測。其中帶熒光標記的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC，靈敏度高，可作為FACS（流式細胞分選）方法篩選凋亡細胞的基礎。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP與PS 的結合比例為1：1，還可進行定量檢測。除此之外，還提供生物素偶聯的Annexin V，可通過常用的酶聯顯色反應來檢測。另外，MACS公司將磁珠包被Annexin V，可采用磁分選方法篩選凋亡細胞。

　　2）細胞內氧化還原狀態改變的檢測：

　　這反應了細胞凋亡研究中相對較新的趨勢，研究什么樣的氧化還原環境引起下游事件的發生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過熒光染料monochlorobimane(MC 體外檢測凋亡細胞細胞質中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細胞內氧化還原狀態的變化。

　　正常狀態下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細胞中，細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉移系統。當細胞內GSH的排除非常活躍時，細胞液就由還原環境轉為氧化環境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環中的重要組分）從線粒體內轉移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。

　　由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關，此項檢測除了對研究細胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風等疾病治療的研究。但有些細胞如：HeLa 和3T3細胞凋亡時沒有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測。

　　3）細胞色素C的定位檢測

　　細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞液，結合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后啟動caspase級聯反應：細胞色素C/Apaf-1復合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

　　細胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在線粒體內膜上的膜蛋白，凋亡發生時，它保留在線粒體內，因而它是線粒體富集部分的一個非常有用的標志。

　　ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心，可從凋亡和非凋亡細胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分，再進一步通過Western雜交用細胞色素C抗體和COX4抗體標示細胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發生。

　　4) 線粒體膜電位變化的檢測：

　　在凋亡研究的早期，從形態學觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機制研究的深入，發現線粒體凋亡也是細胞凋亡的重要組成部分，發生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導后線粒體轉膜電位會發生變化，導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個陽離子性的染色劑，對此改變非常敏感，呈現出不同的熒光染色。正常細胞中，它在線粒體中形成聚集體，發出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細胞液中，發出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用這種原理來檢測線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區分細胞凋亡或其他原因導致的線粒體膜電位的變化。

　　2． 晚期檢測：

　　細胞凋亡晚期中，核酸內切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。對于這一現象的檢測通常有以下兩種方法：

　　1） TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）

　　通過DNA末端轉移酶將帶標記的 dNTP （多為dUTP）間接（通過地高辛）或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果。美國Intergen公司提供多種標記方法，直接熒光標記，地高辛介導熒光標記或過氧化物酶聯顯色，可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。其中，直接標記步驟少，操作簡便。而間接標記有信號放大的作用，檢測靈敏度高。

　　2) LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測)

　　當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR（ligation-mediated PCR）,連上特異性接頭，專一性地擴增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產生的核小體的梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。

　　上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產生這一現象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。

　　3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)

　　這是相對來說推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區重復序列，使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發現，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分別與底物及端粒重復序列配對的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個數的6堿基（GGTTAG）端粒重復序列，通

　　過PCR反應，產物電泳檢測就可觀察到相差六個堿基的DNA Ladder現象（參見圖4）。此外，Intergen公司還提供用酶聯免疫法（ELISA）檢測的試劑盒.

　　同樣，這種檢測方法也不專對細胞凋亡，檢測結果也不純反應細胞凋亡的發生。

　　3．mRNA水平的檢測

　　研究者們發現了很多在細胞凋亡時表達異常的基因，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據報道，Fas 蛋白結合受體后能誘導癌細胞中的細胞毒性T細胞（cytotoxic T cells）等靶細胞。Bcl-2 和bcl-X (長的) 作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調節物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。一般多采用Northern雜交和RT-PCR走膠對它們進行檢測。隨著近年來熒光定量PCR技術的發展，用定量PCR技術來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確。Intergen公司的Amplifluor? Apoptosis Gene Systems就根據這一新技術原理，通過檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X (長的) 基因的 mRNA表達水平來進行細胞凋亡的檢測。

　　以上介紹了針對凋亡不同階段特征的檢測方法，隨著凋亡機制研究的深入，近年來還發展了許多針對特定的凋亡途徑的檢測，如抗體法，酶活性測定等等，Cell Signeling technology公司，DAKO公司，Santa-Cruz公司，Calbiochem & Oncogene公司都緊跟科研潮流，開發了大量的抗體及活性測定產品。

　　隨著對細胞凋亡的研究和認識的不斷深入，對包括腫瘤細胞和組織在內的不同種類病理標本的細胞凋亡的檢測已成為一種迫切需要。目前，多種方法已得到較廣泛的應用。然而如何選擇適當的方法并對檢測的結果作出正確的判斷及愉如其分的解釋仍是值得探討的問題。本文簡要評述幾種常用的細胞凋亡檢測方法。

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　　一、 細胞凋亡的形態學觀察

　　細胞凋亡（apoptosis）的命名主要是根據某些單個細胞死亡時細胞碎裂如花瓣或樹葉散落般的形態學特征。目前對細胞凋亡的認識正不斷得到深化，檢測凋亡細胞的方法也逐漸增多，但形態改變仍是確定細胞凋亡的最可靠的方法。

　　光學顯微鏡觀察

　　凋亡細胞的主要特征為核染色質致密深染，形成致密質塊，有時可碎裂。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小，胞質致密、嗜酸性染色增強，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細胞常以分散單個形式存在，凋亡細胞與周圍細胞分離，不引起炎癥反應。本方法簡便易行，但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標，具有較強的主觀性，重復性差。本方法可用于調亡現象的初步觀察，作為分析指標之一。

　　檢測方法：細胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀察凋亡細胞的形態改變，結合顯微測量工具可作凋亡細胞計數。

　　視頻時差顯微技術（video time-lapse microscopy）

　　本方法用于細胞培養，通過相差顯微鏡可動態觀察細胞凋亡的變化過程，尤其是觀察細胞表和外形的變化。凋胞與基質分離，胞體變圓、收縮、出泡，有的細胞拉長，出現釘狀突起，特續數小時后細胞膜破裂，細胞溶解，通過連續觀察，本方法可養壑培養中的凋亡細胞，但不能用于病理組織。

　　檢測方法：收集2×105細胞/ml培胞，置于多孔培養板，加入凋亡誘導劑，在帶有自動攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細胞的動態改變，每隔分鐘30秒作序列攝影，連續24小時。如同進進行熒光染色，可參熒光晃微鏡下觀察和攝影。

　　電子顯微鏡觀察

　　關于凋亡細胞的超微結構特征，包括透射電鏡和掃描電鏡下的改變，在許我文獻中已有詳盡描述。凋亡細胞的典型形態改變如胞質的固縮，染色質濃縮成半月形或帽狀附于核膜，核的碎裂和凋亡小體形成等，在透射電鏡下得到最佳的體現。為凋亡細胞判定提供了最可靠的依據。本方法的缺點是樣品制作過程較復雜，且儀器、設備的費用昂貴，較難廣泛大量開展。由于樣品范圍局限，在凋亡細胞數較少時需進行大量的觀察才能觀察到典型的凋亡改變。還應指出的是，在觀察體外培養的凋亡細胞時，常可見到各階段的改變，并可見到較多典型的凋亡細胞時，常可見到各階段的改變，并可見到較多典型的凋亡小體很少見到，出現較多的是凋亡初期胞體收縮、染色質邊聚和后期凋亡小體（或整個凋亡細胞）被吞噬和降解的現象。一些不典型的改變容易被忽略，在觀察時要特別予以注意。

　　檢測方法：透射電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。

　　流式細胞技術

　　流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過檢查其光射特征及熒光參數時行的。細胞穿過流式細胞儀的激光束集點時使激光發生散射，分析散射光可以提供細胞大小及結構的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種，前向散射光的強度與細胞大小、體積相產，右向角射光的強度與細胞結構的析射性、顆粒性（granu-larity）有關。細胞凋亡過程中出現的形態改變如細胞皺縮、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發生改變。早期凋亡細胞主要表現為前向散射光減弱而右向角散射光增強或不變，前者反映了細胞的皺縮，后者反映了細胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數的檢測結合起來才能準確地辨認凋亡細胞。

　　細胞凋亡過程中核酸內切酶在DNA分子核小體間的降解，導致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發現在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞。根據此亞二倍體峰可以計算凋亡細胞的百分率。此外，流式細胞術還可以通過測定線粒體膜的電位、溶酶體質子泵的活性及細胞DNA/總蛋白質比例等方法辨認凋亡細胞。

　　檢測方法：獲取密度1×106細胞/ml左右的細胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細胞儀分析。