副溶血性弧菌檢驗（二）

制法：將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，校正pH，加入瓊脂，加熱煮沸使瓊脂溶化，加入0.2％酚紅溶液12.5mL，搖勻，分裝試管，121℃高壓滅菌15min，放置高層斜面備用。
（五）氯化鈉血瓊脂（我妻氏培養基）

制法：調pH8.0，加熱30min（不必高壓），待冷至45℃左右時，加入新鮮人或兔血（5％~10％），混合均勻，傾注平皿。
（六）嗜鹽性試驗培養基

（七）3.5％氯化鈉生化試驗培養基

制法：將上述成分配好后，根據所需的糖發酵管分別加入各種糖類，葡萄糖發酵管可按0.5％葡萄糖加入后，分裝有小倒管的試管內，121℃高壓滅菌15min。其他培養基可分裝為每瓶100mL，121℃高壓滅菌15min，另將各糖類分別配好10％溶液，同時高壓滅菌后，取5mL糖液，加入100mL培養基內，以無菌操作分裝小試管。
（八）葡萄糖食鹽胨水（MR-VP試驗用）

制法：加入1000mL蒸餾水，振搖加熱，使全部溶解，冷卻后分裝小試管，121℃高壓滅菌15min。
（九）食鹽胨水（靛基質試驗用）

制法：按上述分配制，分裝小試管，121℃高壓滅菌15min。
（十）運動性試驗培養基

制法：將全部成分加入1000mL蒸餾水，加熱溶解，分裝試管，121℃15min高壓滅菌，最終pH7.4。

第二節　副溶血性弧菌參考檢驗方法

一、日本食品微生物檢驗方法

（一）分離、菌數測定



圖6-2　分離、菌數測定程序

（二）鑒定

將TCBS平板上生長典型或可疑的菌落挑取2個以上，接種以下培養基：





圖6-3　鑒定程序

（三）檢查用培養基
1. 3％氯化鈉蛋白胨稀釋液：蛋白胨10g、氯化鈉30g溶于1000mL蒸餾水中，校正pH7.0，121℃15min高壓滅菌。
2. TCBS

制法：將上述成分加蒸餾水至1000mL，混合，使全部溶解，校正pH為8.6，加熱煮沸，不需高壓滅菌，傾注平皿15~20mL。
不分解蔗糖的副溶血性弧菌，在此培養基上生長呈藍綠色菌落，分解蔗糖的細菌呈黃色菌落。
3. 我妻氏瓊脂（改良）培養基

制法：將全部成分溶于1000mL蒸餾水中，調正pH為7.5，至完全溶解后，加熱煮沸數分鐘，不需高壓滅菌，冷卻至50℃時，加入洗凈的20％濃度的人紅血球懸液100mL，混合均勻后傾注平皿。
紅血球懸液的制備：將人的脫纖維血液，離心沉淀的血球，用0.85％滅菌生理鹽水洗3次，最后沉淀的紅血球，用生理鹽水制成1:4的懸液。
4. 亞硫酸鉍肉湯

制法：加蒸餾水950mL溶解，調pH為9.1，121℃高壓滅菌15min，室溫冷卻，加亞硫酸鉍溶液100mL及95％酒精1mL，混勻，無菌手續加入滅菌試管，每管100mL，不需加熱。
亞硫酸鉍溶液配制：①熱水100mL，加亞硫酸鈉20g；②熱水100mL加檸檬酸鉍銨0.1g；③將①加②溶解甘露醇20g，煮沸1min，最終成白色混濁的混合物，使用前搖勻。于冷庫貯存，可使用1個月。
5. 食鹽碳水化合物肉湯基礎液

制法：將全部成分溶于1000人工海水中，分裝試管，每管5mL，121℃15min高壓滅菌，冷卻后分別加碳水化合物10％滅菌溶液0.5mL。碳水化合物溶液需過濾或115℃10min高壓滅菌。
人工海水的配制：氯化鈉23.4g，氯化鉀0.66g，硫酸鈉3.91g，重碳酸鈉0.19g，氯化鎂4.96g，將上述全部成分溶于1000mL蒸餾水。
6.Hugh-Leifson食鹽培養基

制法：將上述成分溶解，調pH后加指示劑，分裝試管，每管3mL，121℃高壓滅菌15min。
試驗方法：穿刺接種兩種，一管加礦物油覆蓋表面，于35~37℃培養，兩管同時變黃為葡萄糖發酵，只有不加礦物油的培養管變黃時為葡萄氧化。

二、耐熱溶血毒檢驗方法

根據試驗證明，神奈川現象陽性菌株，多數對人的致病性有密切關系，神奈川現象的陽性物質稱“耐熱性溶血素”，檢驗副溶血性弧菌是否產生耐熱性溶血毒，可參考下述方法：
（一）Sahuria（櫻井氏）法
用副溶血性弧菌肉湯培養物上清液為抗原，與制備的精制耐熱性溶血毒的抗血清進行瓊脂擴散試驗，觀察沉淀線。
（二）Elek法（本田改良法）
以微研No.1瓊脂（Difco胨30g，磷酸氫二鈉30g，氯化鈉40g，葡萄糖5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.3）培養37℃過夜，在平板上菌落旁約為5mm處放一小濾紙片（上吸有抗血清），室溫放一夜，觀察濾紙旁有無沉淀紅。
（三）液體培養檢驗法（飯田民）
用2％氯化鈉肉湯，加入少量新鮮紅血球，傾斜培養，神奈川現象陽性菌株能引起溶血，而陰性菌株不溶血。
（四）反相被動血球凝集法（太田氏）
用吸附抗體的紅血球測定抗原（溶血毒），此方法極為敏感，可查出微量耐熱性溶血毒。并發現神奈川現象陰性的菌株也產生少量的耐熱性溶血毒。

三、至病性試驗方法

　　（一）兔腸袢結扎試驗
選用正常健康家兔，首選使家兔斷食24h，用乙醚麻醉，將腹壁切口，露出小腸，選取腸段約5cm左右，于兩端結扎，注入檢菌的肉湯培養物，同時另選兩段作陽性和陰性對照，然后迅速縫合，24h后由耳靜脈注入空氣殺死，開腹檢查，有致病性者注菌腸段可見腫脹積液，出現壞死現象。
一般認為神奈川現象陽性菌株，兔腸袢結扎試驗多數為陽性反應，神奈川現象陰性菌株多數為陰性，但亦有少數為陽性者。
（二）新生兔經口試驗
選用1~2日齡的新生家兔，將檢菌的培養物經口喂入1~2mL，有致病性者一般可在10~20h發病，初期癥狀蜷縮不動，隨后呈極度疼痛狀，翻滾嚎叫，呼吸急促，痙攣，多數在24h左右死亡，解剖可見內臟充血現象。
無毒株不發病，可對致病性副溶血性弧菌與非致病性溶藻弧菌進行鑒別。

四、血清學檢驗
　
進行副溶血性弧菌血清學鑒定時，可用O抗原分群，將18-24h的培養物，用3％食鹽水作成較濃的菌懸液，121℃高壓1h或100℃煮沸 后，用此菌懸液進行O抗血清玻片凝集試驗，同時用無菌生理鹽水作對照，如O凝集反應陽性時，可用不經加熱的菌懸液進行Ｋ抗血清玻片凝集反應分型判定。
副溶血性弧菌有三種抗原，即O抗原（菌體抗原），Ｋ抗原（莢膜抗原）及Ｈ抗原（鞭毛抗原），日本瀧川氏和坂崎氏，根據對本菌血清學特性的研究，經逐年的進展，將副溶血性弧菌分出11個O群，60個K型，63個血清型。關于Ｈ抗原，因與其他弧菌有共同性，至今在血清型別的分類上沒有利用。副溶血性弧菌的抗原組合見表6-3。

表6-3　副溶血性弧菌的抗原組合