流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）是二十世紀70年代發展起來的，是一項集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、計算機技術以及細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的新型技術，能夠對處在快速直線流動狀態中的細胞或微球進行多參數的、快速的定量分析和分選，且能保持細胞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞。通過熒光探針的協助，它不但可以定量檢測細胞膜、細胞質和細胞核中的各種細胞成份，而且可以研究細胞的各種功能狀態，如細胞增殖、細胞凋亡等，廣泛應用于科研和臨床。本文僅對FCM在免疫學中的應用做一簡要綜述。
1、流式細胞術原理
流式細胞儀的基本工作原理是采用激光作為激發光源，利用熒光染料與單克隆抗體結合的標記技術，通過計算機系統對流動的單個細胞或微粒的多個參數信號進行數據資料處理，從而對目的細胞或微粒進行詳細的分析。FCM常用的熒光染料有FITC（異硫氰酸熒光素）、PE（藻紅蛋白）、PI（碘化丙啶）等，常用的標記方法為直接免疫熒光染色和間接免疫熒光染色，采用的是抗原抗體特異性結合的原理。直接免疫熒光法多用于對細胞表面標志的染色分析，選用單克隆熒光抗體，直接與相應抗原反應。每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體，特異性高，缺點是敏感性偏低。間接免疫熒光法是選用特異性單抗（一抗）與待測細胞結合后，再用熒光二抗（針對一抗的特異性抗體）進行標記染色，形成抗原-抗體-熒光抗體復合物后上機檢測分析。此法應用廣泛，最適宜檢測一些新的未知抗原，進行一些研究分析。這種方法只要標記幾類種屬特異性不相同的二抗即可。由于流式細胞儀及軟件系統的飛速發展，為了獲取雙參數或多參數數據資料，需要進行熒光抗體的組合標記，常采用二色、三色、四色甚至更多標記。
2、FCM在免疫學中的應用
隨著單克隆抗體技術、熒光色素化學等技術的發展，正像免疫學作為一種不斷發展的學科和技術手段延伸到生物、醫學及其他領域一樣，流式細胞術也以它的快速、靈活和定量的特點，廣泛地被應用于免疫學理論研究和臨床實踐的各方面，包括淋巴細胞及其亞群測定、淋巴細胞功能檢測、白血病免疫分型、移植免疫和自身免疫性疾病相關HLA抗原分析中的應用等。
2.1 淋巴細胞及其亞群測定
FCM通過檢測淋巴細胞表面抗原，可以將不同的淋巴細胞亞群區分開，計算它們之間的比例，甚至可以絕對計數。經常測定的淋巴細胞亞群包括T淋巴細胞（CD3＋），T輔助細胞（CD3＋、CD4＋、CD8-），T抑制細胞（CD3＋、CD4-、CD8＋），B淋巴細胞（CD19＋或CD20＋），NK細胞（CD3-、CD16＋、CD56＋）等。通過檢測淋巴細胞表面標志，可了解在不同情況下機體的免疫功能狀態，輔助診斷疾病，指導臨床治療。Fumihito Yoshii等[1]對18例吉蘭-巴雷綜合征（GBS）患者發病初期血液進行檢測則發現，CD3＋、CD4＋和CD4＋、CD45、RA＋T細胞較健康對照組增加，經過血漿置換治療后，這種淋巴細胞亞群的改變趨于正常。正常狀態下CD4＋/CD8＋一般為2/1，但是當患有類風濕性關節炎等自身免疫性疾病時，使用FCM檢測二者的比值就會升高[2]；當患有艾滋病或者其它腫瘤時，使用FCM檢測二者的比值就會下降[3]。淋巴細胞亞群的絕對計數可用于疾病的診斷和治療中，如艾滋病患者的血液中CD4＋T細胞＜200個/μl，而僅有HIV感染而未發病者，則CD4＋T細胞＞200個/μl，淋巴細胞亞群的絕對計數是實驗室檢測發展的趨勢。FCM與傳統的免疫熒光抗體染色后再用熒光顯微鏡觀察，或用細胞免疫組化方法染色后用普通顯微鏡觀察100-200個細胞相比，其結果更為真實和客觀，更具有指導意義。
2.2 淋巴細胞功能分析
淋巴細胞表面抗原的檢測不能完全了解淋巴細胞的功能，需要對細胞內細胞因子或體外培養細胞后進行相關指標測定。檢測細胞因子的方法有酶連免疫斑點法、有限稀釋分析法、RT-PCR法、原位免疫組化法、ElISA法等。每種方法都有自己的特點，但相比較，FCM更有優勢。FCM不僅可檢測細胞群中單個細胞分泌的特有或共表達的不同因子，確定產生細胞因子的陽性細胞的百分率，而且可同時確定陽性細胞的表型，是一種可以在單細胞水平研究細胞因子的有效方法[4]。FCM可在同一細胞內同時檢測兩種不同的細胞因子，也可用多參數流式細胞術對胞內多種細胞因子進行測定。目前，在臨床上利用FCM檢測細胞內細胞因子（Intracellular Cytokine，ICK）來反映淋巴細胞的免疫功能，尤其是T細胞的功能。例如HIV選擇性地作用于宿主的CD4＋T細胞，使之大量耗竭，用FCM檢測CD4＋T細胞產生的細胞因子可間接反映CD4＋T細胞的免疫功能。傳統的形態法、氚標胸腺嘧啶核苷（3H-TDR）摻入法、MTT比色法等均不能反映不同T細胞亞群的增殖狀態，而用活細胞染料羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯（CFSE）標記淋巴細胞，結合流式細胞術可有效檢測出不同T細胞亞群對不同刺激劑的增殖反應以及增殖動力學變化[5]。范艷瑩等[6]用CFSE標記結合流式細胞術研究人外周血NK細胞分裂、增殖和殺傷功能。金齊力等[7]用流式細胞術檢測人γδT細胞對MTB感染THP-1細胞的細胞毒活性，并觀察Il-15對人γδT細胞殺傷MTB感染THP-1細胞的細胞毒活性的影響。
2.3 白血病免疫分型
白血病長期以來主要通過骨髓細胞形態學和細胞組織化學進行診斷，在很大程度上依賴于檢驗者的經驗，主觀性明顯。FCM免疫分型是從造血細胞克隆進化過程中分化抗原表達的角度來認識白血病細胞克隆的特點及分化階段，多參數分析白血病細胞的細胞膜、細胞漿或細胞核的抗原表達。各種血細胞系統都有其獨特的標志，當形態學檢查難以區別時，免疫分型參數對各種白血病的診斷和鑒別診斷有決定作用。例如干細胞表達CD34，髓系表達CD13及MPO，B細胞系表達CD10、CD19、CD20等，T細胞系表達CD2、CD3、CD5、CD7。采用CD45/側散射（SSC）雙參數散點圖設門方法進行三色或四色流式細胞術，可以很好地鑒別各系列，為白血病的診斷、治療及預后判斷提供了重要的實驗室依據。
2.4 HLA-B27的檢測
強直性脊柱炎（Ankylosing Spon-Dylitis，AS）是一種自身免疫性疾病，而HLA-B27（人類白細胞抗原B27）是具有高度遺傳多態性的人類白細胞抗原B座位上的一個等位基因。1973年Brewerton等[8]報道HLA-B27與AS密切相關，Brown[9]報道AS患者HLA-B27陽性率高達94%，而正常人群中僅為9%。用FCM檢測HLA-B27抗原，將單克隆抗體與外周血共孵育，裂解紅細胞，洗滌固定后上機檢測。文獻報道，該法的假陰性和假陽性率小于5%，是一種適用于臨床的、可信賴的檢測方法[10]。由于此法無需分離細胞，比傳統的微量細胞毒實驗節約時間，應用特異性單抗檢測抗原，可以排除交叉反應，提高檢測的靈敏度和準確性。
2.5 移植免疫
目前移植免疫中FCM主要用于交叉配型（Flow Cytometry Cross-Matching，FCXM）和群體反應性抗體（Panel Reactive Antibody，PRA）檢測。1983年Garovoy[11]首次提出了FCXM技術，經不斷完善，已被廣泛應用。研究表明，術前FCXM陽性的心臟移植患者，術后急性排斥反應發生率較對照組高，并且發生動脈粥樣硬化的機率明顯高于FCXM陰性患者[12]；也有報道6例術后FCXM陽性的肝移植患者均在1個月以內發生了急性排斥反應，而FCXM陰性患者中僅17.4%的患者發生了急性排斥反應[13]。由此可見FCXM在器官移植中有著重要的應用價值。PRA檢測的最新進展是免疫磁珠流式細胞儀分析方法（Flow Pratmbeads）。該方法是集智能化和自動化為一體的檢測技術，靈敏度高，特異性高，傳統的補體依賴性淋巴細胞毒試驗（CDC）方法敏感性低、費時且人為誤判多，移植后易發生超急性排斥反應，而ElISA方法很難指明PRA抗體的抗原特異性。Flow Pratm Beads不僅能檢測出PRA含量，而且能指定PRA的種類（抗T細胞抗體，抗B細胞抗體、抗單核細胞抗體甚至抗血管內皮細胞抗體），可以檢測多種類型抗體（IGG、IGM、IGA等），這給臨床醫生提供更具體更有價值的信息，以便更恰當地進行供者選擇。
3、新進展及應用前景
流式細胞儀不斷改進、測定方法迅速發展以及高質量試劑的研制，為提高FCM檢測結果的準確性和分析能力提供了保障。長期以來FCM的應用一直陷于對細胞或顆粒的分析，隨著膠乳顆粒在流式細胞分析中的應用，“液相芯片”技術的出現實現了流式細胞儀對可溶性物質的分析，實現了樣本分析時的低樣本量、多參數檢測。另外，流式微球陣列（CBA）技術也屬于液相芯片技術。這些技術將FCM的應用領域進一步擴展，發展了一種新的技術平臺。可以預見，在未來免疫學基礎研究和臨床檢測領域，流式細胞術的應用范圍會進一步擴大，應用深度會進一步加強。雖然，這種方法還具有一些自身的缺點，如價格昂貴、對操作人員要求高等，但是這些缺點一定會隨著科學技術的進步逐步被克服。