熒光定量PCR在中醫藥研究中的應用

摘要：熒光定量PCR是一種新的核酸定量技術，該技術在PCR儀反應系統中引入了熒光標記探針，通過熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使PCR擴增和終產物檢測全處在封閉的條件下進行，從而具有實時監測、無污染、快速、靈敏、精確、特異等特點，極大的克服了原有PCR儀技術的不足，其最主要的優勢是能對待測樣本起始PCR反應模板進行準確定量，擴大了PCR的應用范圍，熒光定量PCR已廣泛用于生物學及臨床醫學等多個領域，近年來其在中醫藥研究中得到越來越多的應用。 

　　關鍵詞：熒光定量PCR;中醫藥;應用 
　　中圖分類號：R2-03 文獻標識碼：A 文章編號：1673-7717(2008)04-0758-03 
　　 
　　熒光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ PCR)，又稱實時定量（real-time quantitative）PCR，FQ PCR是在PCR技術基礎上發展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術，1996年由美國Applied Biosystems公司首先推出。它是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號來實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析。它的特點是：（1）用產生熒光信號的指示劑顯示擴增產物的量。（2）熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或雙重標記的序列特異性熒光探針或能量信號轉移探針等方法獲得，大大提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。（3）進行實時動態連續的熒光檢測，消除了標本和產物的污染，且無復雜的產物后續處理過程。與傳統的PCR相比，實時定量PCR更加快速、靈敏，并能有效地減少試驗過程中產生污染的危險[1]。 
　　熒光定量PCR的出現克服了傳統PCR技術普遍存在的假陽性及不能定量等問題，使得PCR技術更廣泛的應用于臨床，在監測患者病情、預后、指導用藥等方面有著廣闊的應用前景[2]。熒光定量PCR也越來越多地被應用于中醫藥的研究，為中醫藥理論及其臨床研究提供了更為客觀的物質基礎。 
　　 
　　1熒光定量PCR在中醫藥防治乙肝中的應用 
　　 
　　1.1對乙肝的中醫辨證分型客觀化 量化的探索確定證型是中醫辨證施治的前提，雖然對慢性乙肝的中醫辨證分型已作了統一規范，但這些規范仍停留在傳統的望、聞、問、切上，缺乏統一的量化和客觀公認標準，給大規模的臨床研究和實施循證醫學帶來許多困難。因此，探索慢性乙肝中醫證型與客觀監測指標間的關系，不僅是中醫現代化的要求，也成為中西醫結合的熱點[3]。 
　　有學者觀察慢性乙肝患者乙肝病毒（HBV）復制與中醫證型關系，發現實證較虛證活躍，進一步研究發現慢性乙肝患者易發生HBV前C區突變，而以濕熱中阻型乙肝易發生，脾腎陽虛型乙肝不易發生，表明實證者細胞免疫功能亢進。 
　　而另有人研究發現HBV-DNA按肝郁脾虛、濕熱中阻、竅血阻絡、肝腎陰虛依次遞增。新近的研究表明，乙肝病毒可以分為A、B、C、D、E、F、G、H等若干基因型。在乙肝病毒治療過程中，通常伴隨著HBV病毒的基因型及血清學的轉換。研究發現，基因型的分布與人群和地理位置有關。如在香港地區被證實屬于B型或C型，而在瑞士主要為A型到E型以A型和D型最多。同時不同基因型的乙肝病毒對所用治療藥物的敏感性也有差異[3]。楊麗莎等[4]研究表明乙肝患者濕熱滯留型HBV-DNA含量在5×106～5×109CPS/mL的濃度比例最多，正虛邪戀HBV-DNA含量在5×103～5×105CPS/mL的濃度比例最多，HBV-DNA含量低于濕熱滯留，而高于無癥狀攜帶組，在乙肝病毒含量檢測項目中異常變化順序是濕熱滯留>正虛邪戀>癥狀攜帶，可見病毒含量的濃度與濕熱輕重密切相關，濕熱含量越重者病毒含量越高。而徐秋英等[5]觀察發現HBV-DNA按濕熱中阻、肝腎陰虛、脾虛肝郁、脾腎陽虛、郁血阻絡依次遞減。 
　　根據以上發現，筆者在研究乙肝證型規范化時，若采用熒光定量PCR的方法，并結合乙肝的血清學標志及基因型標志，很可能對乙肝各證型的科學內涵做出更為明確的解釋。 
　　1.2在乙肝的診斷和治療中的價值中草藥抗病毒作用眾所周知，但由于酶免法檢測乙肝標志物不能真實地反映患者體內乙肝病毒的復制情況，在觀察乙型肝炎療效方面缺乏量化的指標，而乙型肝炎熒光定量PCR檢測可以對乙肝病毒的復制水平進行動態觀察，根據患者血清HBV-DNA的拷貝數進行辨證分型，同時預測和評價中草藥及干擾素的治療效果，對臨床有重要指導意義[5]。 
　　傳統的酶免法檢測乙肝病毒標志物檢測的靈敏度一般需要105～7個病原體，熒光定量PCR檢測的靈敏度則可達到0.01fg，相當于2.5個HBV-DNA顆粒。酶免法檢測的是乙肝抗原抗體系統，在特異抗體產生之前，乙肝病毒就已出現在外周血中，但在血液中無法檢測到，這樣就出現了一個免疫學檢測的“窗口期”問題，從而不能真實地反映患者體內乙肝病毒的復制情況。熒光定量PCR是直接從血液中檢測乙肝病毒DNA，這就解決了免疫學檢測的“窗口期”問題，從而判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態或者是現癥感染還是既往感染[5]。 
　　在療效觀察上不能以單純的HBeAg抗原的消失或臨床癥狀的改善和消失為判定依據，在治療的一些肝炎病例中，采用免疫測定法檢測到HBsAg為陽性，而HBeAg為陰性者，不被確診為乙肝活動期，預后也不存在轉陰問題。然而患者的癥狀與乙型肝炎癥狀相似，通過中藥治療后患者大多數好轉，有的甚至痊愈。究竟這些患者是否乙肝活動期、有沒有HBV-DNA，經PCR檢測發現，大多數HBeAg陰性攜帶者存在病毒復制具有傳染性，因此，血清轉化并不能說明HBV的消除及感染性的喪失。這也說明中藥對乙肝有確切的療效，它通過中和乙肝病毒，抑制其復制，并能及時清除抗原-抗體復合物，從而達到疏肝、清肝、瀉肝、平肝、鎮肝、養肝、柔肝、溫肝的治療作用[6]。

　　利用熒光定量PCR技術，可直接檢測臨床標本中的HBV-DNA存在的情況，這對確定患者血液的感染性，乙肝病毒持續感染中疾病的活動情況，進而采取相應的預防和治療措施，以及對中藥抗病毒藥物療效的評價，都具有非常重要的意義。 
　　 
　　2熒光定量PCR在評價中醫藥抗病毒療效中的應用 
　　 
　　近些年越來越多的把熒光定量PCR運用于評價中藥或復方在抗病毒方面作用的研究中，進一步地明確了中藥的治療效果和作用機制，使中醫藥的作用得到更為客觀、定量的體現。 
　　范瑞強等[7]在探討中藥抗病毒膠囊治療生殖器皰疹的研究中運用熒光定量PCR檢測豚鼠生殖道單純皰疹病毒（HSV）2型的含量，發現抗病毒膠囊可以減少脊髓神經節HSV-2DNA的含量。蔡有齡等[8]考察中藥“疣毒清”對尖銳濕疣病毒（HPV）的殺滅作用發現，在提取的HPV中加入中藥“疣毒清”后，在4℃下孵育，按時提取HPV-DNA，用熒光定量PCR法測定其病毒含量，經24h后即不能測出HPV，證實“疣毒清”具有明確的殺滅HPV的作用，找到了其在臨床上單純口服即能治愈尖銳濕疣且不再復發這一事實的機理。李蕓茜等[9]探討黃芪顆粒劑對剛地弓形蟲RH株速殖子感染小鼠的治療作用，用熒光定量PCR檢測肝、肺弓形蟲DNA基因拷貝數，通過比較各組小鼠的平均存活時間發現黃芪可以改善低劑量速殖子小鼠的存活情況。童光東等[10]通過對HBV轉基因小鼠的實驗觀察，證明加味四逆散具有一定的抑制其血清中與肝組織中HBV-DNA的作用。吳建軍等[11]研究雙黃連粉針劑對人巨細胞病毒（HCMV）感染的小鼠肝組織病毒DNA載量的影響，實驗表明雙黃連能明顯降低感染小鼠肝組織中病毒DNA載量，能減輕HCMV型肝炎模型鼠肝功能損害，改善肝臟病理變化。李薇等[12]探討中藥雙黃連注射液對人胚腦單純皰疹病毒Ⅰ型腦炎模型的抑毒作用，實驗證實雙黃連可通過減少病毒DNA的復制，對單純皰疹病毒Ⅰ型腦膜炎模型的病變起到抑制病毒的作用。 
　　 
　　 
　　3熒光定量PCR在中醫藥引起基因表達變化作用中的應用 
　　 
　　俞建等[13]研究滋陰瀉火中藥對青春期大鼠中樞生長相關基因的影響，設立對照組，采用熒光定量PCR法，檢測不同劑量中藥對于青春期大鼠下丘腦及垂體部分生長相關基因的影響。結果滋陰瀉火中藥對于下丘腦促生長激素釋放抑制激素(SRIH)基因表達，中、大劑量治療組顯著增高，表明其可能通過上調SRIH基因表達調節生長激素分泌，從而對青春期大鼠的生長發育起到一定的抑制影響。王琳等[14]應用實時定量熒光PCR方法研究復方861對人肝星狀細胞（LX-2）中а-平滑肌肌動蛋白（а-SMA）基因表達的調節作用。結果表明，復方861在48和72h后可顯著降低LX-2細胞中а-SMA mRNA含量，提示其抗纖維化作用可能與抑制LX-2細胞的活化有關。張黎等[15]研究何首烏水溶性成分2，3，5，4-四羥基二苯乙烯2-Ο-β-D葡糖苷（STI）對溶血磷脂酰膽堿(LPC)誘導人臍靜脈內皮細胞株ECV304細胞中血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響，用熒光定量PCR檢測STI使VEGF mRNA表達成劑量依賴性降低，說明對其有明顯抑制作用，基于VEGF與動脈粥樣硬化的相關性，從而STI可能對動脈粥樣硬化的預防及治療有良好的開發前景。張榮華等[16]觀察益骨膠囊預防和治療用藥對去卵巢骨質疏松大鼠骨組織中的骨重建關鍵性轉化生長因子（TGF-β）的影響，通過檢測TGF-β1mRNA含量，在分子水平上闡明益骨膠囊防治骨質疏松癥的可能作用機制，結果益骨膠囊能促進骨組織TGF-β1mRNA基因表達。張永芳等[17]探討知母活性成分ZDY101對M2受體mRNA穩定性的調節，實驗證實ZDY101能提高M2受體mRNA的穩定性，使細胞M2受體的mRNA含量升高，ZDY101可用于阿爾茨海默病的治療。楊禮騰等[18]運用熒光定量PCR等研究表明，冬蟲夏草的發酵粉末對肺纖維化膠原代謝有明顯的調控作用，其作用機制可能為抑制轉化生長因子TGF-β1mRNA表達的上調，從而干擾TGF-β-smads信號通路對靶基因的激活而實現的。朱昭明等[19]研究通腎絡1號對高糖狀態下大鼠腎系膜細胞金屬蛋白酶2（MMP-2）及其抑制物2mRNA(TIMP-2mRNA)的影響，運用熒光定量PCR法及ELISA法檢測MMP-2、TIMP-2mRNA轉錄水平及細胞培養上清產物FN、ColIV（二者為細胞外基質主要成分）的含量，結果表明通腎絡1號可降低細胞上清FN、ColIV含量，這種作用是通過提高MMP-2mRNA水平，降低TIMP-2mRNA水平，達到升高MMP-2/ TIMP-2比值實現的。這一研究進一步明確了糖尿病腎病的發病機制及通腎絡1號的治療作用。 
　　 
　　4熒光定量PCR在舌診研究中的應用 
　　 
　　許冬青等[20]采用基因芯片及實時定量PCR技術研究舌癌患者不同舌苔舌背黏膜上皮細胞表皮。生長因子受體（EGF-R）表達的差異，以期從基因分子水平探討不同舌苔形成機理，為中醫診斷現代化提供實驗依據。結果表明，不同舌苔上皮細胞EGF-R基因表達水平存在明顯差異，EGF-R可能是影響舌苔形成的重要因素之一。已有報道，不同舌苔的形成與舌上皮細胞凋亡基因的表達及細胞生化代謝等有關，說明舌苔變化可能是多基因聯合調控的結果，其機制有待于進一步深入研究。 
　　 
　　5結語 
　　 
　　綜上所述，熒光定量PCR作為一種新的核酸定量技術，在以前的PCR技術基礎上得到進一步發展，大大降低了假陽性率，工作效率高，結果重現性好，而且不必使用對人體有害的染色劑。在中醫藥迫切需要得到進一步發展的今天，熒光定量PCR技術已越來越多在中醫藥研究中得到應用，除上述應用外，熒光定量PCR還可進一步運用于對中醫證實質的研究及構建中醫證的相關基因表達圖譜，用于探討中醫經絡現象和針灸的作用機理以及對中藥材進行分子生物學檢測，熒光定量PCR必將不斷擴大其應用領域。隨著PCR技術在中醫藥研究中的廣泛應用，它將極大的促進中醫藥的發展，為中醫學走向世界、走向現代化作出貢獻。

　　參考文獻 
　　［1］蔡霞.定量PCR技術及其應用現狀［J］.現代診斷與治療，2005，16（2）：112-115. 
　　［2］鄧少麗，羅陽，陳偉.熒光定量PCR技術及其在臨床上的應用［J］.國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊，2002，23（5）：301-303. 
　　［3］韓凌，韓冰，舒彤.熒光定量PCR技術檢測乙肝患者HBV-DNA的臨床意義及其用于中醫藥預防乙型肝炎的思考［J］.中國中醫藥信息雜志，2005，12（12）：95-97. 
　　［4］楊麗莎，蔣就喜，陳廷生，等.乙肝病毒DNA含量與中醫辨證的研究［J］.四川中醫，2000，18（8）：14-16. 
　　［5］徐秋英，彭勝權，劉亞敏，等.熒光定量PCR技術在評價中醫藥治療乙型肝炎中的價值［J］.新中醫，2002，34（10）：71-72. 
　　［6］徐莉，潘玉貞，鄧魯明. PCR技術及其在中醫藥研究中的應用［J］.中醫藥學報，1997，3：8-9. 
　　［7］范瑞強，李紅毅，禤國維，等.中藥抗病毒膠囊對豚鼠生殖器皰疹模型神經節及大腦影響的電鏡和定量PCR研究［J］.嶺南皮膚性病科雜志， 2001，8（1）：8-10. 
　　［8］蔡有齡，譚淑珍，吳燕.中藥“疣毒清”（Verrucout）對尖銳濕疣病毒（HP V）殺滅作用的實驗研究［J］.中國性病艾滋病防治，2002，8（2）：108-109. 
　　［9］李蕓茜，黃佩君，王祝鳴，等.黃芪對急性弓形蟲RH株感染小鼠的保護作用研究［J］.中國血吸蟲病防治雜志，2004，16（2）：129-132. 
　　［10］童光東，周大橋，劉惠玲，等.加味四逆散抑制HBV轉基因小鼠HBV實驗研究［J］.中西醫結合肝病雜志，2004，14（2）：85-88. 
　　［11］吳建軍，劉貴育，陳貴海，等.雙黃連對人巨細胞病毒感染小鼠肝組織病毒DNA載量影響［J］.中國藥理學通報，2005，21（5）：621-624. 
　　［12］李薇，蔣麗敏，郭巖，等.中藥雙黃連對單純皰疹病毒的抑毒作用［J］.中國現代醫學雜志，2006，16（3）：378-380. 
　　［13］俞建，吳家敏，楊毅，等.滋陰瀉火中藥對大鼠中樞生長相關基因的影響［J］.中國醫藥學報，2004，19（1）：15-17. 
　　［14］王琳，王寶恩，肖培根，等.復方861對人肝星狀細胞а-平滑肌肌動蛋白mRNA表達的調節作用［J］.中草藥，2004，35（10）：1147-1150. 
　　［15］張黎，芮耀誠，丘彥，等.首烏水溶性成分2，3，5，4-四羥基二苯乙烯2-Ο-β-D葡糖苷（STI）對內皮細胞表達VEGF的影響［J］.藥學學報，2004，39（6）：406-409. 
　　［16］張榮華，楊麗，朱曉鋒，等.益骨膠囊對去卵巢骨質疏松大鼠骨組織TGF-β1mRNA基因表達的影響［J］.中藥材，2005，28（4）：312-315. 
　　［17］張永芳，胡雅兒，夏宗勤.知母活性成分ZDY101對M2受體mRNA穩定性的研究［J］.上海第二醫科大學學報，2005，25（4）：368-381. 
　　［18］楊禮騰，程德云，聶莉，等.蟲草菌粉對肺纖維化大鼠肺TGF-β1及其信號通路分子mRNA表達的影響［J］ .四川中醫，2006，24（2）：23-25. 
　　［19］朱昭明，楊素琴，吳以嶺.通腎絡1號對高糖狀態下大鼠腎系膜細胞金屬蛋白酶2及其抑制物2mRNA影響的研究［J］.中國中醫基礎學雜志，2006，12（2）：121-123. 
　　［20］許冬青，佟書娟，詹瑧.表皮生長因子受體在舌癌患者常見舌苔中的表達［J］.上海中醫藥大學學報，2007，21（1）：47-49.