分子生物學實驗診斷技術（一）

一、核酸雜交技術

        檢驗方法建立的基本要素是特異性和靈敏度，在復雜的物體中，使無法感覺的特定物質進入人類的觀察范圍。核酸雜交檢測技術就是利用核酸堿基嚴格配對的特異性，核酸標記物的靈敏度而建立的檢測核酸結構與功能的方法。該法建立以來已有二十年，目前研究實驗室用得多，臨床實驗室用得較少，除成本高外，關鍵是操作復雜，重復性差，僅能半定量。成本高可隨經濟發展而緩和，但其它缺點尚需努力克服。

      雜交實驗的探針應具有特異性，對應不同的雜交方法靶基因（被檢基因）應有一定的純度與豐度。雜交反應的開始是碰撞，探針濃度高則速率增加，一般³²P標記探記探針5-100ng/ml，非放射性探針25-1000ng/ml，原位雜交無論放射還是非放射物標記，一般都需0.1-5.0μg/ml。當探針過量時，雜交速率取決于探針長度，如一個100ng/ml20個核苷酸的合成寡核苷酸探針與1-100pg   1kb長的靶基因雜交，10分鐘能達到最大雜交率。而相同條件下2kb的克隆探針需160小時。主要原因是這里所指濃度是重量濃度而非摩爾濃度。長探針因標記量大，小的摩爾濃度已足以達到需要的檢測靈敏度。為了促進長探針（＞250個核苷酸）的雜交速率，加入雜交促進劑是非常必要的。最常用的是硫酸葡聚糖，使用濃度為5％-10％，濃度過高會增加雜交液粘度。聚乙二醇也作為促進劑，價廉且粘度低，但檢測本底太高。另外雜交的溫度、鹽濃度、甲酰胺濃度可調節雜交分子形成的穩定性。理論選用DNA：DNA雜交溫度T＝Tm－25℃，此時雜交分子最易形成。但具體實驗中影響Tm值的因素很多，一般雜交溫度低，形成的雜交分子較穩定。RNA：DNA雜交分子的Tm大10-15℃，RNA：RNA雜交分子的Tm大20-25℃，使得雜交溫度提高，此時需調節甲酰胺濃度來調節雜交溫度。好的實驗條件最終應在實踐中摸索建立。

（一）斑點雜交

        將少量核酸樣品點樣在硝酸纖維素濾膜上，80℃烘烤后可牢固地固定在膜上，再用探針進行雜交。尼龍膜，特別是聚偏氟乙烯膜（PVDF）與DNA結合力更高，堅韌、易操作。點樣可手工，也可用真空點樣品。檢測可用放射性探針自顯影或非放射性探針顯色。可用于DNA或RNA分析。下面以非放射性探針分析DNA為例，結果是顯色。

       取硝酸纖維素膜和濾紙在2xSSC(NaCl  300mmol/L，檸檬酸鈉30mmol/L)，pH7.0浸15分鐘，平鋪濾紙在點樣抽濾器上，再鋪上硝酸纖維濾膜，真空抽氣使點樣器減壓，膜顯出凹面。點樣50μl（5-10μgDNA，可直接點血清樣品）于凹面，撤去真空，把膜晾干。取濾紙浸0.5mol/L  NaOH，1.0mol/L NaCl，把膜平鋪于濾紙上20分鐘，變性。取濾紙二張分別浸在0.5mol/L Tris-Hcl  pH7.5和1.0mol/L Tris-HCl，0.6mol/L NaCl  pH7.5，分別依次把膜平鋪于濾紙上，各中和15分鐘，中和后膜的pH為7.2-7.5。于80℃，30-45分鐘烘干。（RNA分析點樣緩沖液系統不同，無需變性，中和，余大致相同）用塑料封口機把膜和2.5ml預雜交緩沖液封入塑料袋中，42℃，水浴30分鐘。

50xDenhardt：5g聚蔗糖（Ficoll，400型，Parmacia），5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（組份Ⅴ，Sigma）加水至500ml。過濾后－20℃保存。

探針2ml（50-100ng/2ml預雜交緩沖液）于100℃，10分鐘，馬上置冰浴5分鐘（變性）。加入袋封口。42℃水浴過夜。去雜交液（可回收）。以2xSSC，0.1％SDS15ml，50℃5分鐘洗二次。0.1SSC，0.1％SDS洗二次。封閉：另取袋封入膜和封閉液（蛋白質50mg/ml，100mmol/L  Tris-HCl(pH7.5)/150mmol/L NaCl）2.5ml，37℃，30分鐘。去封閉液（可回收）。100mmol/L  Tris-HCl(pH7.5)/150mmol/L NaCl  ，15ml，5分鐘洗二次。親和反應：酶標抗體3ml（酶有堿性磷酸酶、過氧化物酶等，標記物有抗地高辛、生物素等，現以地高辛標堿性磷酸酶為例4μg/3ml  100mmol/L Tris-HCl，150mmol/L MgCl₂，10mg/ml牛血清白蛋白），封入袋中37℃，30分鐘。100mmol/L Tris-Hcl，100mmol/L NaCl，50mmol/L MgCl₂，pH9.5，10ml，1分鐘洗一次。取硝基四氮唑蘭（NBT）75mg/ml  70％二甲基甲酰胺25μl，4-溴-5-氯-3-吲哚磷酸50mg/ml二甲基甲酰胺20μl（底物）和100mmol/L  Tris-HCl，100mmol/L NaCl，50mmol/L MgCl₂，pH9.5 6ml混勻，37℃，避光反應三小時，顯色。蒸餾水洗膜，晾干。觀察結果。

（二）Southern blot

1975年E.Southern發明了將DNA切開，電泳分離，再變性，印跡到硝酸纖維（Nc）濾膜上，用探針進行雜交，檢測DNA的方法。自顯影或顯色用于DNA分析。以³²P標記放射性探針為例，放射自顯影觀察結果。（圖18-6）。

前述分離、純化的DNA樣品5-10μg/100μl   TE，加限制性內切酶3Unit/1μgDNA和內切酶相應緩沖液，在相應溫度保溫1-3小時（不同的酶所用的緩沖液和溫度不同），乙醇沉淀，15-20μl   TE溶解DNA斷片。前述電泳條件，與DNA分子量標準品（Marker，Ladder）一起，3-4V/cm電泳（30V12-15小時）。在紫外光下觀察Marker充分分離，結束電泳。將膠放入0.5mol/L  NaCl，0.5mol/L NaOH液體中30分鐘，使DNA變性。同時將膜用蒸餾水浸潤，在0.5mol/L NaCl，0.5mol/L  NaOH液體的方盤皿上，放上濾紙兩頭浸在液體中，依次放上凝膠、膜、濾紙、一尺厚的吸水紙，壓力1kg的重物。轉移（印跡，blot）過夜。翌日，把膜放在0.5mol/L  Tris-HCl，pH7.0-7.5，1mol/L  NaCl液中，中和膜上堿性變性液15-30分鐘。戴上手套，用手指壓在膜上來回充分洗膜。室溫干燥一小時。用塑料封口機，把膜和預雜交緩沖液封在塑料口袋中，注意驅除袋內汽泡。熱水浴過夜。探針變性后，加入袋中再封口。熱水浴過夜。