（一）λgt11 cDNA文庫鋪平板
宿主細菌制備
1．用一個E.coli宿主菌株單菌落分別接種2×5ml LB培養基（Y1088用于噬菌斑雜交，Y1090用于免疫篩選），于37℃振蕩培養過夜。
2．將過夜培養物以3000×g離心5min。
3．分別用2ml λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol/L MgSO4; 高壓滅菌）重懸細胞沉淀。
4．細胞懸液可用于4℃貯存至一周。
預制噬菌體懸液鋪平板
以已知滴度（如，已知每ml噬菌體顆粒數）的cDNA文庫或其他噬菌體懸液開始，用λ－dil稀釋以達到所需每平板噬菌體數。每個90mm直徑平皿5×103個噬菌體/100μl開始篩選。
鋪平板
1．將所需數量的LB平板置42℃溫箱預熱。
2．LB頂層瓊脂（每平板最少2.5ml）用微波爐熔化，然后置49℃水浴中。
3．為溫箱內的每一個平板準備一個12ml帶螺旋蓋試管，于室溫，放在合適的架子上。
4．用移液器每管加100μlλ－dil稀釋的宿主細胞懸液。
5．每管加100μl稀釋的噬菌體懸液與細菌于漩渦器上簡短混合。
6．含細菌和噬菌體（感染混合物）的試管于37℃溫育25min，然后室溫放置。
7．用一支消毒的10ml玻璃移液管在本生燈火焰上稍稍預熱，取2.5ml保存在49℃的熔化頂層瓊脂加到一支含感染混合物的試管內。
8．立即在手掌之間滾動混合管內混合物，然后均勻地倒入一個預熱的LB平板上。
9．倒好的平板于室溫置水平面上直至頂層瓊脂凝固（至少5min）。
10．重復步驟7至9，直至所有的細菌和噬菌體混合物都鋪平板。
11．平板置42℃溫箱（對λgt11）直至噬菌斑長出。
（二）雜交篩選——cDNA序列作為探針
1．如上述將文庫鋪平板，噬菌斑雜交實驗用E.coli宿主菌株Y1088。
2．噬菌斑于42℃生長過夜。
3．從溫箱取出平板，置4℃冷卻至少1h。
4．膜剝離：首先，用軟鉛筆在干的硝酸纖維素濾膜上給準備影印的平板編號。其次，從平板的中央開始向邊緣小心將濾膜鋪在菌臺上。當濾膜完全變濕后（顏色變灰），再等30s。同時，用針頭在平板上標出濾膜的3個不對稱位置。小心將濾膜從平板上剝離，接觸面向上放在一張干凈的Whatman
3MM濾紙上。在進行下一步驟之前，所有的平板重復步驟4。
5．將濾膜接觸面向上漂浮在變性液（0.5 mol/L NaOH; 1.5 mol/L NaCl）中5min。
6．中和5min。
7．用2×SSC洗滌5min。
8．將濾膜放在一張新的Whatman 3MM濾紙上，用鉛箔將濾膜和濾紙一起包住。
9．在真空爐中80℃烘烤2h。
10．用6×SSC預先短暫地濕潤濾膜，然后用預洗液（50 mmol/L Tris-Cl pH8.0; 1mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 0.1% SDS）于68℃預洗滌至少1h。用一個盤子放在水浴搖床上。
11．將25張濾膜轉移到一個裝有50ml雜交液（5×SSPE；1×Denhardt’s液；100μg/ml cT-DNA；0.1％SDS）的貯存罐內（直徑至少90mm），68℃預雜交2h。
12．對于每ml雜交液，2倍的105至1×106cpm的雙鏈探針經沸水浴變性10min后，迅速放冰上冷卻。
13．變性探針立即加到預雜交混合液中。
14．在封口的貯存罐內于68℃雜交過夜，不斷地晃動以防濾膜粘在一起。
15．雜交結束后，濾膜用2×SSC，0.01％SDS于室溫洗滌3次約1h。
16．將潮濕（防止干燥）的硝酸纖維素濾膜放在一張硬紙或X光片上，用放射性墨水在針頭標簽上作標記。
17．濾膜用塑料包裝袋（如Saran）包住，然后加上增感屏在X光片上于－70℃曝光過夜。
（三）免疫篩選
制備Sepharose偶聯細菌裂解液
1．各用一個E.coli溫度敏感溶源菌株（BTA 282（λgt11amp3）或BNN 97）單菌落接種于2×7.5ml培養基并于32℃生長過夜。
2．過夜培養物用LB培養基稀釋100倍，于32℃生長至OD600值為0.5。
3．于45℃溫育15min誘導噬菌體表達。
4．培養物于39℃進一步培養約2h。
5．測定噬菌體含量以便收集，氯仿測定操作步驟：3滴氯仿加到1ml培養物測試樣品中，混合物于37℃溫育。另一份不加氯仿的培養物作為平行對照。溫育5min后，測試樣品與對照比較。如果添加氯仿的測試細胞懸液清澈透明，細菌完全被吸附，剛好開始裂解，此時已可收集培養物。
6．于4℃以4000×g離心10min收獲細菌。
7．從開始的兩份7.5ml培養物離心得到的細胞沉淀用冷的偶聯緩沖液重懸并再次離心。
8．各用5ml冷的偶聯緩沖液重懸細胞沉淀。
9．超聲波處理細胞懸液，直到粘度增加至不再釋放出核酸。
10．將細菌裂解物偶聯到預先制備好的溴化氰活化Sepharose 4B于4℃過夜。
11．以3000×g離心5min回收偶聯物。
12．用偶聯緩沖液重懸沉淀并再次離心。
13．為了飽和溴化氰活化Sepharose的未結合反應基團，沉淀物用冷（4℃）的飽和緩沖液重懸并在旋轉輪上于4℃溫育1h。
14．通過三次連續的洗滌除去未吸附蛋白質，開始用洗滌緩沖液（pH4.0）；然后轉換至pH8.0；最后一次洗滌pH為4.0，在這個處理前后和每次洗滌之間，在4℃，2500×g離心5min，收集材料。
15．Sepharose偶聯細菌裂解液可以PBS懸液（＋0.01％硫柳貢）于4℃貯存幾個星期。
用于篩選的抗體預吸附
1．濃度為0.5至1
mg/ml未稀釋的第一抗體和第二抗體（如過氧化物酶偶聯羊抗兔抗體，Calbiochem公司）分別用1.7倍體積的Sepharo se偶聯細菌裂解液混合，并在旋轉輪子上于4℃溫育過夜。每次篩選循環約需要300μl已處理的第一抗體（最終工作稀釋度為1：100）和15μl已處理的第二抗體（最終工作稀釋度為1：2000）。
2．懸液加到少量玻璃棉填充的加樣器吸頭內。未封閉抗體用冷凍封閉液（至少5倍于柱體積）洗脫。
3．用冷的封閉液調節洗脫出的抗體濃度至原先濃度的1/20。加入硫柳汞（終濃度0.01％）。
鋪平板
1．如上所述鋪制平板，作如下修改：
a. 另外一支含2.5ml頂層瓊脂的12ml帶螺旋蓋試管置49℃水浴中以鋪制誘導對照平板。
b.在一份感染混合物中，用100μl噬菌體懸液含已知百分比的具有完整β-半乳糖苷酶基因的野生型噬菌體作為誘導對照。
c. 在加相應感染混合物前，為鋪制誘導對照平板20μl X-gal立即加到2.5ml頂層瓊脂中。
2．于42℃溫育3～4h（用E.coli Y1090）直至噬菌斑可見。
3．將平板移到層流櫥內，用IPTG浸泡過的硝酸纖維素濾膜覆蓋在上面以誘導噬菌體lacZ基因表達。對每個平皿，用軟鉛筆在干的硝酸纖維素濾膜上編號，然后在平皿內用IPTG溶液浸泡。排去平皿邊緣多余的液體，然后從平板的中央開始往邊緣小心地將濾膜放在長有細菌的平板上。濾膜總是用平頭鑷子操作。
4．于37℃溫箱倒置培養過夜。
5．誘導對照平板上的某些噬菌斑過夜培養后，由于完整的β-半乳糖苷酶表達將變成藍色，表明IPTG誘導成功。
6．從平板上剝離濾膜前，應該用針頭在濾膜上標出3個不對稱位置。
7．然后小心地從平板上剝離濾膜，接觸面向上放在Whatman 3MM濾紙上，直至所有的濾膜揭下。
免疫學染色
1．, 為了洗去頂層瓊脂上的殘余物和細胞碎片，將硝酸纖維素濾膜一次最多5張轉移放在搖床上的盤子（10×10cm）內，用25ml TBS室溫洗滌10 min 2次。
2．然后濾膜用25ml封閉緩沖液（每張90mm直徑的濾膜至少15ml）于室溫溫育30min，以封閉濾膜上的非特異性結合位點。不斷晃動以防濾膜互相粘在一起。
3．每張濾膜置佩特里平皿中，各用3ml含預吸附第一抗體的封閉緩沖液溫育。多克隆第一抗體的經典工作稀釋度為1：100。抗體的這種工作稀釋度可以重復使用到5次并于4℃保存。室溫下用第一抗體溫育至少2h。為了確保濾膜仍然完全浸泡在抗體溶液中，溫育過程中，將平皿放在搖動平臺上。
4．室溫下用25ml TBT洗膜3次，每次10min，并不斷搖動以除去未結合第一抗體。
5．本步驟操作同步驟3。3ml封閉緩沖液內預吸附第二抗體的工作稀釋度通常為1：2000（如過氧化物酶偶聯羊抗兔抗體，Calbiochem公司）。第二抗體工作溶液使用不得超過一次。第二次使用后，第二抗體工作溶液的吸附能力似乎耗盡，經常導致陽性信號的突然丟失。
6．用25ml TBS于室溫下搖動洗膜3次，每次10min以除去未結合的第二抗體。
7．在一個塑料盤內，45ml冷（4℃）的酶反應緩沖液與5ml冷（－20℃）的氯萘酚和50μl H2O2混合。將濾膜一次最多5張放在顯影液內并緩慢攪動。幾分鐘內陽性噬菌斑顯示出紫紅色。
8．如果用Polaroid攝影術（665型膠卷，光圈4.5，快門速度1/15，橙色濾光片）記錄結果，將硝酸纖維素膜放在曝光箱內。
9．為了有助于挑取陽性菌體斑，在拍照的透明膠片上用針頭做相應的標記。
噬菌斑純化
1．用一支消毒的鈍頭巴斯德吸管刺入對應于陽性菌體斑位置的頂層瓊脂，通常很容易從平板上取下薄的環狀頂層瓊脂并用0.5ml λ-dil重懸于一支Eppendorf管內。