定量PCR的技術原理及實驗的具體步驟

多年以來PCR技術只作為一種高靈敏的定性技術而被應用，既制約了PCR質量控制的建立，又大大制約了PCR技術的應用，近年來定量PCR的出現為PCR的應用開拓了廣闊的前景。

原理：經典PCR一般分為擴增和檢測兩個階段,常用溴乙錠染色,凝膠電泳為定性檢測手段。由于定性實際上就是定量的一種粗約表現，因此只要對檢測手段進行改進就可以實現精確定量。熒光標記技術是分子生物學最常用的標記技術，熒光染料或熒光標記物與擴增產物結合后，被激發的熒光強度和擴增產物成正比。而根據擴增原理，擴增是呈指數增長，因此在反應體系和反應條件完全一樣下，樣本含量應與擴增產物的對數成正比，故在一定的條件下熒光強度和樣本含量成正比。 

方法1：非特異性染料結合法 利用某些熒光素能和雙鏈DNA結合，結合后的產物具有強的熒光效應。當擴增結束后，隨溫度的降低，DNA復性成為雙鏈熒光素與之結合，經激發產生熒光，測定熒光強度，通過內標或外標法求出因數，可以準確定量。優點：簡單易行，成本較低。缺點：熒光素的結合非特異，熒光素和引物二聚體等有結合，在低樣本濃度時影響大，不能進行突變分析和雙色分析。 

方法2：雜交探針標記法 用熒光素標記在探針上，由探針與靶基因特異性結合成雙鏈而產生熒光效應。上圖所示是雜交探針標記法的一種，用兩種熒光素標記兩對探針。其中一種標記于3`端，一種標記于5`端，同時這兩種熒光素其中一種所發熒光恰好是另一種的激發光。當其分散在液體中時，因為距離大，當一種產生的熒光不足以激發另一種的熒光，當與靶基因特異結合后，兩者距離很小，故激發出另一種熒光。優點：減少了非特異性誤差，可以進行雙色分析和突變分析。 

優點：定量PCR可以得出準確的定量結果，改變了PCR只用作微量物定性測定的歷史，并可進行動態檢測和病程療效分析。同時讓質控的建立成為可能，以保證結果的準確性。能對基因突變進行分析。