分子生物學實驗中，常常需要從瓊脂糖凝膠或聚丙酰胺凝膠中回收DNA，進行純化、探針標記或進一步擴增等。鑒于PCR反應具有高度敏感性，微量模板即可擴增出陽性產物。我們從瓊脂糖凝膠中直接回收DNA進行PCR，取得較滿意的結果，報道如下。
1 材料和方法
1.1 試劑 Taq DNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖、PstⅠ內切酶、pUCm-T載體、E.coli JM109細菌購自上海生工生物工程公司，PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit和Advantage cDNAPolymerase Mix購自Clontech公司。
1.2 方法
1.2.1 目的基因片段 由本室應用抑制消減雜交法獲得 ［1］ ，片段大小約200～700bp。由于PCR產物的3’末端均帶有一個多聚腺苷酸A，pUCm-T Vector設計了胸腺嘧啶T尾，可與PCR產物直接連接，并轉化感受態細胞。將轉化后的E.coli JM109細菌接種于含氨芐青霉素和IPTG-Xgal的LB瓊脂培養基中，37℃培養過夜。從陽性克隆中挑取單個菌落，按常規堿裂解法提取小量質粒DNA ［2］ ，PstⅠ內切酶切，2%瓊脂糖凝膠，100V電泳檢測。
1.2.2 凝膠中DNA的快速回收 用刀片將瓊脂糖凝膠中的特異性EB著色條帶切下，置入含20μl雙蒸水的Ep管內，用無菌吸嘴將凝膠搗碎，置4℃過夜。
1.2.3 PCR擴增回收DNA片段 由于小鼠生精細胞凋亡相關基因片段是采用抑制消減雜交法經巢式PCR擴增而得，故進行PCR擴增回收DNA時用的引物為巢式PCR的內側引物:Nested PCR primer1∶5’-TCGAGCGGCCGCCˉCGGGCAGGT-3’和Nested PCR primer2R:5’-AGCGTGˉGTCGCGGCCGAGGT-3’。反應體系包括模板1～3μl，引物Nested1和Nested2R各0.4μl，dNTP（250μmol/L）0.5μl，Taq酶（2U/μl）1μl，10×PCR反應buffer1μl，補足水至反應體積10μl。在PE9600型PCR擴增儀上擴增，反應條件:94℃1min;94℃10sec，68℃30sec，72℃1.5min，30個循環，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2 結果
從凝膠中直接回收DNA進行PCR的結果見圖1，圖中可見陽性條帶清晰，背景干凈。M:pUC Mix marker;1～10:回收DNA的PCR擴增
3 討論
通常從凝膠中回收和純化DNA的方法有壓碎浸泡法、透析袋洗脫法和低熔點瓊脂糖法。壓碎浸泡法與本法雖有相似之處，但須反復洗脫和DNA抽提，操作繁瑣;透析袋洗脫法不僅須反復洗滌，而且需要透析袋，并且不能回收大片段DNA;低熔點瓊脂糖法試劑較昂貴，須抽提DNA，而且回收率較低。本研究利用固相中高濃度的DNA可向低濃度溶液中轉移的原理，將含擬回收DNA片段的凝膠塊置入雙蒸水中，搗碎、浸泡后，直接取液相進行PCR反應，方法簡單、快速，不需DNA的抽提和純化，擴增陽性條帶清晰，背景干凈，表明直接回收法所獲取的DNA不僅在量上，而且在純度上均可滿足PCR擴增的模板要求。該法同樣適用于從聚丙酰胺凝膠中回收DNA片段，有推廣應用價值。
參考文獻
1 姜宏，李麓蕓，盧光.小鼠生精細胞凋亡相關基因的分子克隆.生物化學與生物物理學報，2001，33（4）:421-425.
2 姜泊，張亞歷，周殿元.分子生物學常用實驗方法，北京:人民軍醫出版社，1996，3-4.
