大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化

1、感受態細胞：應用一些特殊方法（如點擊法，CaCl2處理）處理后，使細菌細胞膜通透性發生暫時的改變，處于能允許外源DNA分子進入的狀態，即為感受態細胞。

2、轉化(Transformation)：是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。

CaCl2轉化法的基本原理是細菌在低溫，低滲（0℃0.1mol/LCaCl2）的溶液中，菌體細胞膨脹成球形，局部失去細胞壁或細胞壁溶解，外來的DNA可形成抗DNase的羥基--鈣磷酸復合物黏附于細胞表面，經42℃短暫熱沖擊處理，促使DNA復合物進入細胞，從而實現外源基因的轉化。

實驗器材  ①超凈工作臺；②恒溫搖床；③離心機；④V-1100分光光度計；⑤水浴鍋；⑥微量移液器。

實驗步驟 

1.感受態細胞的制備和保存

制備

（1）將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘。    

（2） 棄去上清,用預冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘。    

（3）棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液。

保存

感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存于-70℃可保存半年。

轉化

（1）從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。   

（2）加入pBS質粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。   

（3）42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。   

（4）向管中加入1ml LB液體培養基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。     

（5）將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿,37℃培養16-24小時。