細胞化學染色檢驗（三）

【染色結果及正常血細胞反應】陽性反應為細胞質中出現藍色沉淀。
1． 原粒細胞陰性或陽性，早幼粒細胞至成熟中性粒細胞呈陽性反應，不被氟化鈉抑制。
2． 原始單核細胞陰性或陽性，幼單核細胞和成熟單核細胞均呈陽性，能被氟化鈉抑制。
3． 淋巴細胞陰性或陽性，不被氟化鈉抑制。
4． 巨核細胞、血小板均呈陽性。
5． 早期幼紅細胞呈陽性，隨著細胞的成熟陽性程度逐漸減弱、此反應不被氟化鈉抑制。
【臨床意義】臨床意義基本同α-NAE染色，可用于輔助診斷急性白血病類型。
1． 急性單核細胞白血病，單核系細胞陽性，此反應能被氟化鈉抑制。急性粒－單細胞白血病部分白血病細胞陽性，部分陰性，氟化鈉抑制率與兩類細胞的比例相關。
2． 急性粒細胞白血病之原粒細胞可陽性，此反應不被氟化鈉抑制。急性早幼粒細胞白血病，顆粒異常增多的早幼粒細胞呈強陽性，此反應不被氟化鈉抑制。
3． 急性淋巴細胞白血病，白血病細胞呈弱陽性或陽性，此反應不被氟化鈉抑制。
4．酸性α-醋酸萘酚酯酶(acid α-Naphthyl acetate esterase, ANAE)
【原理】血細胞中的酸性α-醋酸萘酚酯酶(acid α-Naphthyl acetate esterase, ANAE)在PH弱酸性（PH5.8）的條件下，水解基質液中的α-醋酸萘酚，產生α-萘酚，萘酚與六偶氮付品紅形成紅色的沉淀。
【染色結果及正常血細胞反應】陽性反應為細胞中出現藍色沉淀。
1． 單核系細胞常呈強陽性。
2． T淋巴細胞陽性，B淋巴細胞多數為陰性。
3． 粒系細胞、紅系細胞、巨核系細胞含量較少。
【臨床意義】酸性α-醋酸萘酚酯酶(acid α-Naphthyl acetate esterase, ANAE)染色主要用于單核細胞白血病與其他白血病的鑒別。
1． 急性單核細胞白血病呈強陽性（彌散分布）。
2． 急性粒細胞白血病常呈陰性或弱陽性，急性早幼粒細胞白血病呈較強陽性反應（彌散分布）。
3． 急性T淋巴細胞白血病時，常呈點狀顆粒或塊狀陽性。
4． 臨床曾用于鑒別T、B淋巴細胞，現在T、B淋巴細胞的鑒別主要用流式細胞儀進行，所以該染色法已很少采用。用于T、B淋巴細胞的鑒別時，成熟T細胞呈點狀顆粒或塊狀陽性，B細胞大多陰性，偶見稀疏、彌散的細小顆粒。

5. 酯酶雙染色
在同一張涂片上進行兩種酯酶染色稱為酯酶雙染色。可采用特異性酯酶和一種非特異酯酶染色。常用的為氯乙酸AS-D萘酚酯酶和α-萘酚丁酸酯酶。反應原理基本上與各自的染色原理，同一張涂片上的血細胞要分別在兩種不同的基質液中反應一段時間，然后復染觀察。酯酶雙染色時，急性粒－單細胞白血病同一張涂片上出現兩種酯酶染色陽性的細胞，或者同一種細胞呈現兩種酯酶染色陽性，而其他急性白血病不具備此特征，因此酯酶雙染色對輔助診斷急性粒－單細胞白血病有獨特的價值。 返回
四、過碘酸－雪夫染色（periodic acid-Schiff staining PAS）
【原理】過碘酸-堿性品紅中的過碘酸是氧化劑，可以打開多糖類物質（糖原、糖蛋白、粘多糖、粘蛋白及糖脂）的乙二醇基CHOH-CHOH，形成雙醛基（CHO-CHO），后者與雪夫試劑(schiff)中的無色堿性品紅結合成紫紅色化合物。
【染色結果及正常血細胞反應】PAS陽性結果：胞漿內出現紫紅色顆粒、珠狀、塊狀或片狀，細胞核為藍色。
1． 粒細胞系統：分化差的原始粒細胞為陰性，分化好的原始粒細胞至中性分葉核粒細胞均呈陽性反應，隨著細胞的成熟，陽性反應程度逐漸增強，陽性呈細顆粒、均勻紅色；嗜酸性粒細胞中的嗜酸性顆粒不著色，顆粒之間的胞質呈紅色，嗜堿性粒細胞中的嗜堿性顆粒呈陽性，而顆粒之間的胞質不著色。
2． 紅細胞系統：幼紅細胞及成熟紅細胞均呈陰性。
3． 單核細胞系統：分化差的原單細胞為陰性，其他呈陽性，大多數陽性為細顆粒狀，有時分布于細胞邊緣的顆粒較粗大。
4． 淋巴細胞系統：大多數陰性，少數陽性，陽性顆粒呈粗顆粒或珠、塊狀。
5． 巨核細胞系統：巨核細胞、血小板陽性，呈粗顆粒或珠、塊狀。
6． 其他細胞：漿細胞一般陰性，少數陽性，呈細顆粒狀；巨嗜細胞可為陽性，呈細顆粒狀。

圖7 ALL PAS呈珠狀和塊狀 圖8 M3細胞PAS易見柴束狀結晶

圖9 AHL PAS 圖10 高雪細胞PAS呈強陽性

【臨床意義
1． 急性淋巴細胞白血病：原、幼淋細胞PAS陰性或陽性，陽性率升高，陽性反應物多呈中粗顆粒、粗顆粒散在分布；珠狀和塊狀圍繞核周(圖7)。慢性淋巴細胞白血病時淋巴細胞的陽性率增加，呈粗顆粒狀或塊狀；惡性淋巴瘤時淋巴瘤細胞陽性率高、陽性強、呈塊狀或粗顆粒狀；Reed-Sternberg細胞則為弱陽性或陰性反應。
2． 急性粒細胞白血病：原粒及早幼粒細胞呈陰性或弱陽性，陽性反應物多為細顆粒彌散狀。異常早幼粒細胞的PAS反應呈強陽性，陽性反應物為密集的細顆粒彌散狀，胞漿邊緣及外漿處多分布粗大顆粒，大部分病例細胞胞漿內易見柴束狀結晶(圖8)，少數病例在細顆粒彌散狀基礎上可見1～2個小珠。
3． 單核細胞白血病：原、幼單核細胞PAS較粒細胞強，陽性反應呈細顆粒彌散分布，部分夾雜中粗顆粒、粗顆粒，胞質邊緣及偽足處呈大粗顆粒，少部分在此基礎上可見小珠，少數可見裙邊樣反應。
4． M4EO異常嗜酸粒細胞：PAS可見深粉紅色小珠。ANLL Auer小體PAS陽性。
5． 微分化型AL(M0)：PAS可為細顆粒、中粗顆粒散在分布；部分在此基礎上可見小珠。
6． 紅細紅胞系統疾病：紅血病、紅白血病、骨髓增生異常綜合征中幼紅細胞可陽性（呈均勻紅色或塊狀），有時幼紅細胞陽性反應強且陽性率高，甚至紅細胞也呈陽性。在某些紅系良性疾病，如缺鐵性貧血、地中海貧血中幼紅細胞可陽性，有時陽性率也較高；巨幼細胞貧血、溶血性貧血、再生障礙性貧血等幼紅細胞可陰性，有時個別細胞可呈陽性。
7． 巨核細胞白血病：原始巨核細胞PAS呈陰性或陽性反應，部分為細顆粒彌散狀，部分表現為強陽性，陽性反應物為中粗顆粒、粗顆粒散在分布，部分可見小珠或塊狀。小巨核細胞PAS呈細小顆粒彌散狀，邊緣處為粗顆粒及小珠。
8． 嗜堿粒細胞白血病的嗜堿粒細胞PAS為強陽性，陽性物多表現粗顆粒、珠狀、塊狀。與幼稚淋巴細胞PAS較難鑒別。
9． AHL： PAS部分細胞呈細顆粒彌散狀，部分細胞呈粗顆粒、珠狀(圖9)。
10． 漿細胞PAS弱陽性，一般呈淡粉色看不清顆粒，極少數病例可見粗顆粒和小珠。
11． 高雪細胞PAS呈強陽性反應(圖10)；尼曼-匹克細胞為陰性或弱陽性，空泡中心陰性。以此鑒別高雪細胞和尼曼-匹克細胞。
12． 骨髓轉移瘤細胞PAS大部分呈強陽性；腺癌細胞PAS呈強陽性反應，表現為紅色顆粒或塊狀。
13． 組織嗜堿細胞PAS強陽性，細顆粒彌散狀，部分可見大粗顆粒。 返回
五、中性粒細胞堿性磷酸酶染色(neutrophilic alkaline phosphatase,NAP)
【原理】中性粒細胞堿性磷酸酶 (neutrophilic alkaline phosphatase,NAP)染色的方法有Gomori鈣－鈷法和Kaplow偶氮偶聯法。Gomori鈣－鈷法染色原理是堿性磷酸酶在堿性條件下將基質操作液中的ß－甘油磷酸鈉水解，產生磷酸鈉，磷酸鈉依次與硝酸鈣、硝酸鈷、硫化胺產生一系列反應，形成不溶性棕黑色沉淀，定位于酶活性所在部位。較為繁瑣、所需時間長。
Kaplow偶氮偶聯法：成熟中性粒細胞堿性磷酸酶在PH9.6左右的堿性環境中，能水解基質液中的磷酸萘酚鈉底物，釋放出萘酚，后者與重氮鹽偶聯，生成不溶性的有色沉淀，定位于細胞質酶活性所在之處。該方法為目前所常采用。不同的底物與重氮鹽的組合不同，化學反應過程以α-醋酸萘酚鈉為例
【染色結果及正常血細胞反應】陽性反應為細胞質中出現不溶性灰黑色到棕黑色顆粒。NAP主要存在于中性成熟粒細胞（包括中性桿狀核粒細胞和分葉核粒細胞），呈陽性反應，其他細胞基本呈陰性。反應結果以陽性反應細胞的百分率和積分值來表示。反應強度分為5級，其分級及積分值如下：
－，0分，細胞質中無陽性反應顆粒。
＋，1分，細胞質中含少量陽性反應顆粒或細胞質呈彌漫淺灰色。
2＋，2分，細胞質中含中等量陽性反應顆粒或細胞質呈彌漫灰黑色。
3＋，3分，細胞質中含較多陽性反應顆粒或細胞質呈彌漫棕黑色。
4＋，4分，細胞質中充滿粗大陽性反應顆粒，甚至遮蓋細胞核，或細胞質呈彌漫深黑色。 
血液涂片經染色反應后，在油浸鏡下，連續觀察100個成熟中性粒細胞，記錄陽性反應細胞所占百分率即為陽性率；并對所有陽性反應細胞逐個按其反應強度作1＋～4＋的分級，將各級所占百分率乘以級數，相加即為積分值。通常成人NAP陽性率10～40％；積分值40～80分。注意不同的觀察者的記分標準有所不同，結果易受主觀因素影響，因此參考值變化較大。NAP積分明顯增高或明顯減低者，臨床意義較大，同時應排除生理性影響。
圖11 為不同陽性反應強度的示意圖

圖11 中性粒細胞堿性磷酸酶染色：1.中性粒細胞胞漿呈彌漫淺灰色（+）， 2.胞漿中有稍致密的棕黑色片狀沉淀（2+）， 3.胞漿中充滿棕黑色顆粒（3+）， 4.胞漿中充滿棕黑色顆粒，并有一部分遮蓋了細胞核，（4+） 5.淋巴細胞。
【臨床意義】
1． 生理性變化
（1） 年齡變化：新生兒NAP活性增加，以后下降。兒童各年齡段相似，成人較兒童活性減低，老年期更低。
（2） 應激狀態：緊張、恐怖、激烈運動等NAP活性可增加。
（3） 月經周期中的變化：經前期增高，行經后減低，經后期恢復。
（4） 妊娠期的變化：妊娠2～3個月的NAP積分值輕度增高，以后逐月高，分娩時達高峰，產后恢復正常。
2． 病理性變化
（1） NAP積分增加：見于細菌感染、再生障礙性貧血、某些骨髓增殖性疾病（如慢性中性粒細胞白血病、骨髓纖維化、真性紅細胞增多癥、原發性血小板增多癥），慢性粒細胞白血病之加速期及急變期，急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、惡性淋巴瘤、骨髓轉移瘤、腎上腺糖皮質激素、ACTH治療后等。
（2） NAP積分下降：慢性粒細胞白血病慢性期，陣發性睡眠性血紅蛋白尿、骨髓增生異常綜合征、惡性組織細胞病等。
3． 疾病的鑒別
（1） 類白血病反應與慢性粒細胞白血病：前者明顯增加，后者明顯下降且積分常為零。
（2） 慢性粒細胞白血病慢性期與慢性中性粒細胞白血病：前者明顯下降且常為零，后者明顯增加（常在300分以上）。
（3） 細菌感染與病毒感染：前者明顯增加，后者在正常范圍或略降低。
（4） 再生障礙性貧血與陣發性睡眠性血紅蛋白尿：前者常增加，后者常下降。
（5） 急性白血病類型鑒別：急性粒細胞白血病常下降，急性淋巴細胞白血病常增加，急性單核細胞白血病一般正常或減低。
（6） 惡性組織細胞病與反應性組織細胞增多癥：前者常下降，后者無明顯變化。
（7） 真性紅細胞增多癥與繼發性紅細胞增多癥：前者常增加，后者無明顯變化。
（8） 原發性血小板增多癥與繼發性血小板增多癥：前者常增加，后者無明顯變化。 返回
六、酸性磷酸酶（Acid phosphatase ACP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase TRAP）染色
【原理】酸性磷酸酶與細胞的許多生理功能和病理變化有關。用聚丙酰胺凝膠電泳發現，血細胞的ACP由7種同功酶組成(ACP 0,1,2,3,3b,4,5)。同功酶0存在高雪細胞、單核細胞和巨噬細胞；1、2、4中性粒細胞；1、4單核細胞；3b各型AL的原始細胞內；3淋巴細胞；5 毛細胞，具有獨特的抗酒石酸的功能，是HCL所特有的；也有提示高雪、巨噬細胞也有。在某些血液病時，同功酶的出現與疾病特點和占優勢的細胞類型有關。酸性磷酸酶染色法有硫化鉛法和偶氮偶聯法。硫化鉛法的染色原理為血細胞內的酸性磷酸酶在酸性條件下（PH5.0）將基質液中的ß－甘油磷酸鈉水解，產生磷酸根，磷酸根與硝酸鉛作用生成磷酸鉛，定位于胞漿中的磷酸鉛再與硫化銨反應生成棕黑色硫化鉛沉淀。偶氮偶聯法的染色原理為血細胞內的酸性磷酸酶能使底物磷酸AS-BI萘酚水解，釋放出不溶性萘酚，后者與偶氮染料堅固石榴紅結合，形成紫紅色顆粒沉淀于胞質內。
抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase） 染色 用相同方法制備兩分基質液，一分加入適量的L-酒石酸（tartaric acid），另一分不加酒石酸。取兩張相同標本的涂片，分別用這兩種不同的基質液作酸性磷酸酶染色。如果血細胞內的酸性磷酸酶耐酒石酸，兩張均呈陽性；如不耐酒石酸，則不加L-酒石酸者呈陽性，加L-酒石酸者呈陰性反應。
【染色結果及正常血細胞反應】硫化鉛法的陽性反應為棕黑色硫化鉛沉淀，偶氮偶聯法陽性反應為紫紅色顆粒。粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、巨核細胞、血小板、漿細胞、巨嗜細胞呈陽性（圖12）。
【臨床意義】
1. 幫助診斷多毛細胞白血病（hairy cell leukemia HCL）：多毛細胞白血病時多毛細胞ACP呈陽性或強陽性反應，且其活性不被L-酒石酸抑制，有助于本病的診斷（圖13，14）。
2. 幫助鑒別T和B淋巴細胞：在人體發育中，T淋巴細胞的酸性磷酸酶出現在發育早期胸腺細胞階段，并持續到成熟。定位于Goigi器中，所以大多數急性和慢性T淋巴細胞增生疾病都表現ACP活性，陽性物多呈顆粒型，也可以為陰性，以T-ALL的反應最強，B淋巴細胞增生的ACP反應弱陽性或陰性.
3. 高雪細胞和尼曼-匹克細胞的鑒別：高雪細胞ACP呈強陽性反應；并具有抗酒石酸功能。尼曼-匹克細胞呈陰性或弱陽性反應。
4. 急性髓系白血病的ACP反應：原始單核和幼稚單核細胞ACP為強陽性反應；原粒細胞對ACP反應不一，早幼粒細胞和中幼粒細胞ACP較弱，異常早幼粒細胞較強。
5. 用于ALL和ANLL的鑒別：ALL陽性物多為顆粒型。ANLL呈彌散狀。
6. 漿細胞ACP呈較強的陽性反應，陽性物為大粗顆粒和珠狀散在分布于細胞漿內。
7. 轉移瘤細胞強陽性。 返回

圖12 酸性磷酸酶染色：1.巨核細胞 2.原始粒細胞 3.中性分葉核粒細胞 4.單核細胞 5.中幼紅細胞 6.淋巴細胞。

圖13 HCL ACP呈強陽性 圖14 HCL TRAP陽性

七、骨髓鐵染色（ferric stain）
【原理】正常骨髓中有一定量的鐵，以含鐵血黃素的形式存在于單核巨噬細胞系統細胞的胞漿中，稱細胞外鐵。中、晚幼紅細胞胞漿中亦含有鐵顆粒稱細胞內鐵或鐵粒幼細胞。骨髓中的鐵在酸性環境下與亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位。
【染色結果及正常血細胞反應】骨髓中出現藍色顆粒為陽性。
1． 細胞外鐵 觀察骨髓小粒中的鐵，呈彌散藍色、顆粒狀、小珠狀或塊狀。按陽性程度分為5級（圖15）。通常正常為1＋～2＋，大多為2＋。
“－”骨髓小粒上無藍色呈現（提示骨髓儲存鐵缺乏）
“1＋”有少量藍色顆粒，或偶見小珠。
“2＋”有較多的鐵顆粒和鐵小珠。
“3＋”有很多鐵顆粒、小珠、和少數藍黑色小塊。
“4＋”有極多的鐵顆粒和小珠，并有很多密集成堆的小塊。
2． 細胞內鐵 觀察幼紅細胞內的鐵。正常幼紅細胞（主要是晚幼紅細胞）的細胞周圍可以見1～5個呈藍色細小的鐵顆粒。含有鐵顆粒的幼紅細胞稱為鐵粒幼細胞。在油浸鏡下，連續計數100個幼紅細胞，記錄鐵粒陽性的幼紅細胞數，即為鐵粒幼細胞所占的百分率。需同時注意細胞內的鐵粒數目、大小、染色深淺和排列。如含粗大深染的鐵粒數目在10個以上，并環繞細胞核排列超過核周徑2/3以上者，稱為環狀鐵粒幼細胞。鐵粒幼細胞所占的百分率通常為20％～90％，平均值65％（由于各實驗室的試驗條件不同，參考值也有差異，各實驗室應建立自己的參考值）。 
【臨床意義】
1． 缺鐵性貧血早期骨髓中的儲存鐵就已耗盡，細胞外鐵呈“－”。鐵粒幼細胞的百分率減低，<15％，甚至為“0”。經鐵劑治療后，數天內鐵小粒出現在幼紅細胞中，但細胞外鐵需待貧血糾正一段時間后才會出現。因此，鐵染色是目前診斷缺鐵性及指導鐵劑治療的可靠和切合臨床實用的檢驗方法。
2． 非缺鐵性貧血如溶血性貧血、巨幼細胞貧血、再生障礙性貧血及骨髓病性貧血等，細胞外鐵多增加，常>3＋～4＋。肝硬化、慢性腎炎、尿毒癥、血色病等，細胞外鐵明顯增加而鐵粒幼細胞可減少。
3． 鐵粒幼細胞貧血時，因血紅素（heme）合成障礙，鐵利用不良，鐵粒幼細胞增多，并可見到環狀鐵粒幼細胞，占幼紅細胞的15％以上。骨髓增生異常綜合征（MDS）中，難治性貧血伴環狀鐵粒幼細胞增多（RAS）這一類型，鐵粒幼細胞也增多，環狀鐵粒幼細胞>15%。

鐵染色“－” 鐵染色“1＋

鐵染色“2＋” 鐵染色“3＋” 鐵染色“4＋”
圖15 鐵染色的陽性度分級 返回
細胞化學染色小結
正常人血細胞以及白血病原始細胞的細胞化學特征
POX SBB esterases PAS ACP CE α-NAE α-NBE
原始粒細胞 －/+ －/+ －/+ －/+ _ －/+ _早幼粒細胞 +/2+ +/2+ +/2+ －/+ _ +/+ +/2+中幼粒細胞 2+ 2+ +/2+ －/+ _ 3+ + 單核細胞 －/+ －/+ －/+ 3+ 2+/3+ + 2+淋巴細胞 _ _ _ －/+ －/+ －/+ -/2+原始紅細胞 _ _ _ －/+〔1〕 _ _ +/_ 巨核細胞 _ _ _ 3+ + 2+ 2+

POX SBB esterases PAS ACP CE α-NAE α-NBE
ALL － －/少數＋ － －/+〔2〕 － ＋/++典型為珠、塊狀 －/+〔3〕 HAL －/+ －/+ ＋可為小珠狀AUL － － － － － － －M0 － － － －/+ 可為2＋，可為小珠狀M1 －/+ －/+ － ＋/－ －/+ ＋ ＋/－M2a ＋ ＋ 多為－ －/+ －/ + ＋/－ －/+ M2b 2＋ 2＋ 2＋ 2＋ －/+ ＋/－ －/+M3 3＋ 3＋ 3＋ －/3＋ － ＋/－/2+細顆粒狀 －/2＋M4 2+ 2+ 2+ 2+/3+NaF抑制 2＋ －/2＋ 2＋M5 －/+ ＋/－ ＋/－強于pox,SBB 3+ NaF抑制 3+ 2+ 2+M6 － － － 2＋ ＋ 2＋ －M7 －/ PPO+ － － ＋ －/+ 2＋ 2＋小巨核酶標＋MM ＋ ＋ 轉移瘤 2＋ 3＋ 2＋

注釋：－陰性，＋/－弱陽性，＋中等陽性，2＋中強陽性，3＋強陽性（多數細胞）
注〔1〕α-NAE在紅白血病以及一些紅系統成熟障礙疾病可表現為強陽性。
注〔2〕α-NAE在少數ALL的細胞漿出現點狀陽性物，這類ALL傾向于T-ALL。
注〔3〕ACP在T-ALL為強陽性，在非T-ALL為弱陽性。