循環腫瘤細胞（CTC）是從原發性腫瘤部位“逃逸”到循環系統中，并隨著血液循環和淋巴循環“定居”到其他組織部位的細胞。“定居”的CTC可以在遠端器官中增殖，侵蝕正常組織。CTC可以認為是癌癥組織在人體內散播的“癌癥種子”，這些“種子”的生根發芽引起的癌癥轉移是導至絕大多數與癌癥相關的死亡的重要原因。CTC的檢測分析可以幫助癌癥患者進行早期預后分析，確定癌癥的發展階段，并診斷性設計治療方案。與傳統的實體腫瘤組織活檢相比，CTC的檢測或液體活檢有兩個優勢：01 CTC的檢測或活檢是非侵入性的。CTC的檢測或活檢只需采集患者的外周血樣本即可進行。驗血容易，安全，不容易受患者主觀意愿影響。02 CTC的檢測或活檢可以隨時間采集多個樣本，根據采集到的CTC反映的癌癥進展信息可以適當調整癌癥的治療方案。相對而言，對實體瘤的分析需要侵入性手術，采集樣本比較繁瑣，風險更大。但是另一方面，CTC在外周血中的數量非常稀少，通常每毫升血液中只有幾個細胞存在，這提高了CTC的檢測難度。此外，CTC的表面標記個體差異較大，這使得開發高靈敏度和特異度的檢測技術難度極大。
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CTCs的檢測方法
免疫細胞化學
（immunocytochemistry，ICC）
ICC利用抗原抗體結合的反應原理，首先使用單克隆抗體與特異性的腫瘤標志物反應，然后通過酶底物反應顯色來判斷腫瘤細胞的存在。CTC的標志物主要分為三類（1）上皮細胞角蛋白（CK），最常用的CK蛋白是CK19；（2）上皮細胞膜特異性抗原，最常見的是EpCAM；（3）腫瘤相關糖蛋白（TAG）。通常CTC的ICC特異性標志是EpCAM+CK+DAPI+CD45-；而白細胞的標志是EpCAM-CK-DAPI+CD45+。通過ICC可以將CTC從大量的淋巴細胞懸液中分離出來。ICC的優點是能夠分離出CTC并保持細胞形態；然而由于CTC的異質性，其細胞表面抗原不均一，導至ICC對CTC的檢測并不敏感。FCM同樣是利用抗原抗體結合的反應原理來篩選細胞的。流式細胞術可以將單克隆抗體制作稱為熒光探針，通過熒光探針與CTC的特異性表面抗原來標記CTC。通常使用的熒光抗體是EpCAM和CD45。FCM的優點是可以在鑒定CTC的同時，檢測細胞形態和進行DNA倍數分析。其缺點是需要大量的血液樣本才能滿足FCM檢測的統計學要求，另外FCM檢測CTC同樣受制于CTC的表面特異性抗原的異質性。RT-PCR的原理是利用逆轉錄酶將腫瘤特異性mRNA序列逆轉錄為DNA，然后通過PCR反應擴增特異性的DNA片段，從而檢測血液樣本中是否存在CTC特異性的mRNA。通常情況下，在CTC的特異性mRNA的選擇上主要有以下幾種途徑：（1）某些基因改變后RNA水平的異常表達，例如p53、ras的點突變，BRCA1、BRCA2的缺失突變，CD44產生異構體、某些基因異常擴增（ERBB2，EGFR）等；（2）組織特異性標志的mRNA如mucin，cytokeratin，ER，maspin；（3）腫瘤特異性標志mRNA，如CEA，β-HCG等。RT-PCR的檢測CTC的優點是靈敏度高、重復性好、價格低廉；其缺點是mRNA的表達具有不穩定性、檢測過程必須破壞CTC、假陽性率高。
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CTCs的富集方法
通常CTC的大小、密度和電學特異與外周血的其他細胞有顯著的差異，通過這些差異可以設計出相應的CTC的分離方法。（1）利用CTC的大小和機械性能分離CTC，其主要原理是CTC的體積約在15-30μm，而普通的細胞的直徑在8-11μm的范圍內，通過使用微孔濾膜、尺寸依賴的微流控芯片就可以將CTC從外周血中分離出來；（2）利用CTC的細胞密度的特異性，通過Ficoll密度梯度離心將CTC從單個核細胞中分離出來；（3）利用CTC的電學性能的特異性，通過電旋轉或者雙向電泳，可以將CTC從外周血分離出來。這種方法捕獲的CTC能夠保持較高的捕獲效率，并且保持細胞的活性。CTC具有特異性的表面marker分子，通過這些特殊的marker設計分離磁珠，可以同時對CTC進行分離和檢測。免疫磁珠分選CTC主要有直接捕獲的陽性富集法和去除其他細胞的陰性福激發。其主要原理是針對CTC表面主要表達的上皮細胞黏附分子（如：EpCAM）、細胞角蛋白（如：CK19）和腫瘤特異性抗原（如：HER2）使用交聯特異性抗體的免疫磁珠從外周血中捕獲CTCs。最典型的是Cell
Search系統，利用免疫磁珠捕獲細胞，在使用FCM和ICC對細胞進行鑒定和計數。這種方法的優點是方便、有效、分離的CTC純度高，并且能保持細胞活性。其缺點是價格昂貴、檢測敏感性受CTC表面抗原表達的制約，并且CTC經過EMT后，其EpCAM等分子會丟失。
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CTC的臨床意義
體外早期診斷：通常的腫瘤的影像學診斷在癌癥的初期很難診斷出來。但是循環腫瘤細胞可以在癌癥的早期即可在血液中檢測到。因此循環腫瘤細胞可以作為癌癥早期篩查比較有潛力的指標。根據循環腫瘤細胞個數進行患者預后生存時間：大量的研究表明，循環腫瘤細胞可以作為癌癥預后生存時間的有效指標，其靈敏度要高于常見的影像學診斷。癌癥治療的療效評估：通常情況下，癌癥病人在接受癌癥治療后（放療、化療、免疫治療）的三個月后評估癌癥患者的治療效果。通過CTC檢測可以在治療后的幾周內反應癌癥患者的腫瘤狀況，這樣可以及時地對癌癥療法進行評估和反饋，從而針對性地盡快進行下一步的治療方案的設計。
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CTC的研究現狀
2004年發表在新英格蘭上的一項多中心研究中[1]，研究者對177例轉移性乳腺癌患者的循環腫瘤細胞水平進行了測試。實驗組中循環腫瘤細胞水平等于或高于每7.5
ml全血5的患者，與每7.5 ml全血中腫瘤細胞少于5的組相比，其中位無進展生存期更短（2.7 個月vs. 7.0個月，P
<0.001）且總生存期也更短（10.1個月vs.> 18個月，P
<0.001）。在開始治療后的首次隨訪中，兩組之間的這種差異持續存在（無進展生存期：2.1個月vs. 7.0個月，P
<0.001；總生存期：8.2個月vs.> 18個月，P <0.001
），且預后不良的患者比例從49％降低到30％，表明治療有益處。多元Cox比例風險回歸表明，在統計模型中的所有變量中，基線和首次隨訪時循環腫瘤細胞的水平是無進展生存期和總生存期的最重要預測指標。轉移性乳腺癌患者治療前CTC水平是有效的預后預測因子。CTC計數小于5的患者無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)均顯著高于CTC計數大于等于5的患者(Figure
1)。△Figure
1 Kaplan-Meier Estimates of Probabilities of Progression-free Survival
and Overall Survival in Patients with Metastatic Breast Cancer for Those
with <5 Circulating Tumor Cells per7.5 ml of Whole Blood and Those
in the Group with ≥5 Circulating Tumor Cells per 7.5 ml of Whole Blood
before Initiation of a NewLine of Therapy.2008年發表在J
Clin
Oncol.的一項研究[2]根據CTC水平分為CTC數量大于3個（7.5ml全血）的不良預后組和少于3個（7.5ml全血）的有利預后組。與基線CTC較差的患者相比，中位無進展生存期（PFS；4.5
v 7.9個月，P = .0002）和總體生存期（OS；9.4 v 18.5個月，P
<.0001）較短。治療后1、2、3、5、6至12和13至20周持續存在差異。與在兩個時間點均具有不良CTC的患者相比，基線不良CTC在3至5周轉換為有利的PFS和OS顯著更長（PFS，6.2
v 1.6個月，P = .02；OS，11.0 v 3.7個月，P =
.0002）。在非進展性患者中，影像學檢查后1個月內CTC較不良CTCs生存時間更長（18.8 v 7.1個月，P
<0.0001）。調整臨床重要因素后，基線和后續CTC水平仍是PFS和OS的有力預測指標(Figure 2)。
△Figure
2 (A) Overall survival in metastatic colorectal cancer patients by
imaging response,(B) circulating tumor cell (CTC) yield within±1 month
of imaging, and (C) both imaging response and circulating tumor cell
yield within ±1 month of imaging. Overall survival (OS) values were
calculated from the time of the baseline blood draws. PR, partial
response; CR, complete response; S, stable disease; PD, progressive
disease; FU, follow-up.2011年發表在J
Clin
Oncol.的一項針對非小細胞肺癌（NSCLC）的循環腫瘤細胞的研究中[3]，研究者對101例未接受過治療的III期或IV期NSCLC患者進行了標準治療前后的CTC分析。結果表明IV期NSCLC患者（n
= 60;CTC數量范圍從0至146）的7.5 mL血液中的CTC數量高于IIIB期（n = 27;
CTC數量范圍從0至3）或IIIA期疾病（n =
14；未檢測到CTC）。在單變量分析中，少于5個CTC的患者與化療前5個或更多CTC的患者的無進展生存期為6.8 v 2.4個月，P
<.001，而總生存期（OS）為8.1 v 4.3個月，P
<.001。在多變量分析中，CTC數量是OS的最強預測指標（危險比[HR]為7.92；95％CI為2.85至22.01；P<.001），并且通過在一個化療周期后采集的第二個CTC樣本，可以增加HR的點估計值（HR=15.65；95％CI，3.63~67.53；P
<.001）（Figure 3）。△Figure
3 Kaplan-Meier curves for (A, C) progression-free survival (PFS) and
(B, D) overall survival (OS) of patients with < five and ≥ five
circulating tumor cells (CTCs) in 7.5 mL of blood at baseline, including
(A, B) analysis of all patients (N = 101) and (C, D) analysis of
patients with stage IV disease only (n = 60).
M.Cristofanilli,
G.T. Budd, M.J. Ellis, A.T. Stopeck, J. Matera, M.C. Miller,J.M.
Reuben, G.V. Doyle, W.J. Allard, L.W.M.M. Terstappen, Circulating
tumorcells, disease progression, and survival in metastatic breast
cancer, The NewEngland Journal of Medicine, 351 (2004) 781-791.
S.J.
Cohen, C.J.A. Punt, N.Iannotti, B.H. Saidman, K.D. Sabbath, N.Y.
Gabrail, J. Picus, M.A. Morse, E.P.Mitchell, M.C. Miller, Relationship
of Circulating Tumor Cells to TumorResponse, Progression-Free Survival,
and Overall Survival in Patients WithMetastatic Colorectal Cancer,
Journal of Clinical Oncology, 26 (2008)3213-3221.
M.G.
Krebs, R. Sloane, L.Priest, L. Lancashire, J.-M. Hou, A. Greystoke,
T.H. Ward, R. Ferraldeschi, A.Hughes, G. Clack, M. Ranson, C. Dive, F.H.
Blackhall, Evaluation and PrognosticSignificance of Circulating Tumor
Cells in Patients With Non–Small-Cell LungCancer, Journal of Clinical
Oncology, 29 (2011) 1556-1563.
