自2010年6月第一款核酸POCT檢測產品GeneXpert上市以來，七年間，陸續有十幾個快速核酸檢測產品面市，以圖1為例，部分核酸POCT檢測產品及上市時間如圖所示。
圖1 部分核酸POCT產品上市情況
在這些產品逐漸揭開神秘面紗時，作為科研愛好者（研發labor）都不禁會對產品中獨具匠心的設計產生興趣，并努力剖析解密。今天，我們就來扒一扒核酸檢測產品中的化學試劑部分是如何存在并成為檢測系統中的一員的。
核酸擴增檢測試劑包括核酸提取純化、核酸擴增與檢測等幾種組分，按成分來說，主要包括引物、探針（帶熒光、淬滅基團或電化學檢測基團等）、各種酶類、dNTP、增強劑、表面活性劑、鹽以及防腐劑等。表面活性劑、鹽和引物等小分子化合物只要能夠保持在一定濕度、溫度條件下，保存不難。但含有標記物的探針和酶類等生物大分子易降解或變性，是試劑能否穩定存在的關鍵。
從試劑保存形式上來說，大部分核酸POCT試劑卡/盤需要在室溫下保存，這就要求化學試劑不能以液態形式存在，必須經過脫水處理，以固體形態存在。使用時，以緩沖液復溶進行后續反應。試劑脫水方式通常有兩種，一種是點膠干燥，另一種是凍干珠形式。二者的比較如表1所示，下面談一下兩種形態試劑的生產過程。
表1 試劑干燥方式——點膠干燥與凍干珠比較
1、點膠干燥
點膠干燥（Dry Down）在體外診斷試劑的生產中較常見，比如血糖試紙，就是將微升級反應試劑，含酶和底物等，以加樣槍/點樣系統加到膜或卡上，以高于室溫的溫度，如45℃進行烘干。
1.1 制造過程
首先點膠，或稱噴墨打印，即將液體用移液器分散到物體表面（通常是PCR反應腔室表面），然后至于烘箱內進行干燥。干燥分為一步法和兩步法。一步法指在一個溫度下干燥一定時間，兩步法指分階段溫度進行干燥。下面以Biocartis公布ZL內容解析兩步法干燥過程。其ZL中提及，先以某一溫度T1（<40℃）進行干燥30min，使水等揮發物含量達到10%左右，再以溫度T2（>80℃）干燥30min，然后結束干燥過程，最終液體揮發性物質含量<2%。其意義在于，T1溫度較低，快速移除絕大部分的可揮發物，而盡可能減少大分子生物的降解。因為失去揮發物后，剩余部分液體變得粘稠，大分子移動性變差，減少了降解的可能。T2溫度較高，盡可能地除去殘留揮發物。
1.2 試劑組分
為了保證活性損失盡可能小，除核酸檢測所必需的試劑外，還可以加入多糖等大分子物質，不僅是賦型劑也是活性保護劑。此外，也應考慮到非揮發類組分對于大分子穩定性的影響，包括無機鹽，其在溶液中濃度低影響小，一旦水分等物質揮發掉，無機鹽濃度明顯升高，可能對大分子的穩定性有影響。以Biocartis一項公開ZL中的成分舉例，除PCR試劑外，其余組分和組成分別為：海藻糖0.15~0.3M，BSA5.5~6.5mg/ml以及甘油5~15%。
實際開發過程中，先確定PCR試劑組成后，再分別對賦型劑、保護劑以及干燥溫度與時間等進行摸索，通過檢測PCR產物選定最佳試劑組成。需要特別注意的是，干燥后是否易復溶對實驗的影響也較大，理想狀態是室溫下，干燥試劑快速復溶，不需溶液反復溶解。
1.3 設備要求
點膠干燥的設備主要有移液槍/點樣系統和烘箱。通常研發過程中做試劑組分與干燥條件篩選時，不需同時點很多樣本，用移液槍即可。制造過程點樣為了控制一致性及提高生產效率，需要用到點樣系統。點樣系統有許多成熟產品供選擇，占有率較高的品牌是Biodot，國產品牌較少。
烘箱只要滿足一定溫度準確度及通風要求即可，根據干燥試劑量等選擇相應干燥箱。下圖2為相關設備的示例。
圖2 點膠干燥相關設備示例
2、凍干珠（Lyo-beads）
2.1 制造過程
制造過程分為三個步驟。第一步混勻各試劑與賦型劑，注意在低溫下操作，以保留酶等的生物活性并且按照一定順序加樣，每種試劑完全溶解并混勻后再加下一種試劑。混勻后試劑膜過濾。第二步試劑成型，凍干珠的行成是通過將液滴滴在低溫液體中，或滴在低溫固體表面以行成其特定形狀，如球體。低溫液體可以用液氮，沸點低于-150℃。第三步冷凍干燥。利用普通的凍干機可以完成冷凍干燥，需控制壓力。干燥過程在于減少生物活性損失，盡量保持原有形態。如果干燥過程過快，活性會有損失。可通過控制壓力使緩慢干燥以提高活性。
2.2 試劑組分
類似于點膠干燥體系，凍干珠的試劑配方里除核酸檢測試劑必需組成外，還需包括賦型劑和保護劑等物質。
賦型劑通常是惰性物質，包括蔗糖、葡萄糖、海藻糖、松三糖、右旋糖苷和甘露醇，以及聚合物類PEG和PVP等。賦型劑類型影響凍干珠的吸濕性，凍干珠的濕度應達到3%左右。賦型劑量應適當，量少不能成型，量多難復溶。具體多少需實驗摸索。保護劑如蛋白類包括BSA、明膠、膠原蛋白等。
核酸POCT檢測產品中的賽沛即采用凍干珠形式保存核酸提取與擴增檢測試劑。在其一篇公開的ZL中提到，凍干珠內含68~75%的甘露醇作為賦型劑，甘露醇可以降低其吸濕性至可接受的范圍，并最終獲得球體，表面光滑的凍干珠。而海藻糖具有高吸濕性，會導至凍干珠之間的重量不一致，還可能會導至凍干珠之間相融。含水量高的凍干珠內活性損失明顯。
2.3 設備要求
凍干珠制造的設備要求明顯高于點膠干燥，所需設備包括分液儀器、凍干珠儲存裝置以及冷凍干燥機。
下圖3為分液儀器IVEK DigispenseTM 700system。分別為分液儀器的控制主機（控制分樣體積，分樣頻率等），電機/基底/泵（提供動力，貯存液體），活塞/氣缸套（噴射液體）
圖3 分液儀器IVEK Digispense 700 system
PCR體系體積一般在5~200μl，凍干珠分裝的體積在2-15μl之間，這樣它才能在工作溶液5-200μl中溶解。凍干珠子需要浸沒在液氮里大概20-30s，在這過程中它會被分隔器分開防止珠子之間融合。
使用ZLUS20070259348舉例說明凍干珠的分裝方法和注意事項。圖4a表示，當液體滴到疏水處理的容器中時，會形成一個圓形的小球。圖4b中502代表分液器的滴頭， 508代表液氮進，510表示液氮出。當液氮進出時會使506表面冷凍，形成一定的低溫環境，可以使液體滴落后迅速凍干；504突起形成一個個單獨的空間，固定小球；這一整個裝置控制了板的表面溫度，使分液頭往下滴液體時不會造成頂端液體凝固，同時能使液體接觸表面后能立馬凝固。圖4c中，220代表該裝置的蓋子，當處于FIG.3A時，能保持這種沒有蓋嚴的狀態放入凍干機進行凍干，當凍干結束時可以將蓋子壓緊（FIG.3B）后，再放到其它房間進行分裝。圖4d為該分隔器的俯視圖。機器控制分液系統是多種的，有很多款分液頭，4，8，10，20，24通道，這些全部都是為了能夠同時分配液體到在列/橫里面。
a b
c d
圖4凍干液體分裝步驟和分隔器
圖5為ZLUS20140294872中的截圖，圖中整個裝置的目的是控制金屬板的表面溫度使分液頭往下滴液體時不會造成頂端液體凝固，同時能使液體接觸表面后能立刻凝固。方法與圖4的大同小異，圖5中的加熱層結構為多個散熱翅片組成，它的一端接觸金屬板，一端置于液氮的表面，從而達到降溫的效果。
圖5 凍干珠在固體表面成型
下圖6為ZLUS8758701B2的凍干珠溶解裝置截圖。105是有浮力的固定小球與100腔室之間有一個間隙，凍干珠的直徑比間隙大，因此不能通過。當液體從106進液口進入腔室，腔室內的空氣就會從110排氣口排出（排氣口為一層膜，只能氣體通過，液體不能通過）。一定體積的溶解液體進入腔室后，108凍干珠就會慢慢變成118溶解后變小的凍干珠，最后全部溶解（液體在腔室內孵育一段時間，有可能有加熱或者混勻的操作）。此時利用壓差，從120通氣口通入氣體，迫使液體從122通道排出，或者利用重力使液體慢慢流出腔體。圖6.B和C也是溶解裝置，但不同的構想。圖6.B是一個橫截面為六邊形的固體，它的邊緣132與腔室緊密連接，而邊緣之間有空隙，液體和氣體都可以通過。圖6.C是腔體橫截面不是圓形的裝置，它的上方固定了一個橫截面為圓形的小球，這個小球與腔體之間也有空隙，使液體和氣體都能通過。
圖6 凍干珠溶解裝置
產品實現時，究竟用點膠干燥還是凍干珠與試劑卡的設計密切相關。同時，也要考慮制造的難度與成本等。