1.3 靶向-NGS（tNGS）技術的應用
超多重PCR兼具PCR對于特定微量DNA模板的特異性擴增性能以及多個片段同步擴增的能力，配合NGS測序，會擁有比普通宏基因組，全外顯子組測序更為靈敏的特定基因檢出率，此外前期建庫流程更加簡便易行并具有相當大的成本優勢。目前tNGS技術的應用范圍至少包括遺傳疾病檢測、癌癥檢測、人類身份鑒定和傳染病檢測等幾個方面。
圖2. 超多重PCR-NGS技術應用范圍（來源：Thermo Fisher官網） 1.3.1 遺傳疾病研究及相關檢測 在輔助生殖領域，胚胎植入前基因篩查（PGS）可以幫助提高懷孕成功率。這一檢查需要在胚胎發育的第2天或第5天檢查是否發生基因組異倍體性，由于此階段可用于檢測的胚胎細胞細胞數量極少，用超多重PCR的方式進行全基因組規模的擴增會大大增加檢測的敏感性和特異性。將tNGS用于新生兒進行相關檢查、遺傳病及攜帶者篩查的最大優勢在于一次檢出通量大于傳統檢測方法，同時相比于外顯子組測序具有更低的價格。 在科學研究領域，tNGS方法同樣具有獨特的優勢。2015年，協和醫院發表文章利用超多重PCR-NGS技術研究限制性心心肌病（restricted
cardiomyopathy,
RCM）中MYBPC3基因突變與遺傳性心臟病表型之間的相關性。研究人員選擇具有家族世代關系的3位RCM患者以及1位零散發生RCM的不相關患者進行了原發性心肌病相關64個候選致病基因的超多重PCR，并利用NGS確認了3位家族性RCM成年患者攜帶相同的MYBPC3的無義突變（基因翻譯提前終止導至無法生成功能性蛋白），不相關的RCM患者攜帶MYBP3的錯義突變，并且該結果被測序的金標準Sanger測序法所證實。 1.3.2 癌癥基因檢測 除了對多種靶向藥基因突變進行同時鑒定以指導用藥之外，超多重PCR對于微量DNA信號的特異性放大能力在cfDNA檢測及血液腫瘤治療后微小殘留病（MRD）的鑒定等領域都具有極大的優勢。 在2019年發表的一項研究中，UCSF
Benioff兒童醫院的研究人員利用超多重PCR技術對青少年慢性骨髓單核細胞性白血病（JMML）的造血干細胞移植前（pre-HCT）化療是否影響疾病的分子負擔以及對造血干細胞移植后（post-HCT）效果的影響進行了研究。針對21位JMML患者，研究人員通過tNGS分別對pre-HCT化療前后驅動基因突變的頻率進行檢測，發現pre-HCT化療造成分子響應和無響應的患者其造血干細胞移植后五年無進展生存率分別為100%和61%，顯示了利用tNGS進行HCT預后評估的潛在能力。 圖3. 經tNGS驗證對于化療響應的患者具有更高的預后（來源：Pediatr Blood Cancer） 1.3.3 病原微生物檢測 由于臨床上對于常見致病微生物的種類已有相對明確的認知（~1000種），因此，針對病原微生物設計tNGS體系，以實現臨床感染樣本，尤其是復雜感染樣本內各類病原體的靈敏性檢出，是解決目前臨床病原體診斷領域諸多問題的一種非常有效的手段。但針對病原微生物檢測的超多重PCR體系相比于人類遺傳病基因檢測或癌癥基因檢測，需要在更小的基因組范圍內考量上百甚至上千個不同種屬間基因片段的特異性擴增，體系設計難度更大，故在這一領域還未出現絕對的龍頭企業。但tNGS法可以優秀的性能及可接受的成本彌補現今臨床多種病原檢測方案的諸多缺點，應用前景值得期待。關于臨床病原體檢測及tNGS在其中的應用將在下文進一步介紹。 二 感染性疾病及臨床病原微生物檢測技術
2.1 感染性疾病概述
感染性疾病是臨床常見的多發病，是全球死亡率和發病率最高的疾病之一。廣義的感染性疾病包括所有病原微生物感染引起的疾病。這些病原體以病毒和細菌為代表，主要包括立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、真菌、放線菌、朊病毒、寄生蟲等物質。感染性疾病廣泛存在于臨床各個科室中，如ICU，外科、心血管科、神經科、呼吸科、血液科、泌尿科、內分泌科、生殖科等，一直以來都是人類健康的重要威脅。
病原微生物的診療已成為臨床醫生及感染控制工作者共同關注的焦點，主要包括及時正確地進行感染源的診斷以及從抗菌譜與抗菌作用、藥理特性和不良反應等方面選擇合適的抗菌藥物兩方面。病原微生物檢測可以從病原體種類、藥敏以及毒力等因素評估感染情況，從而為感染性疾病的治療及預防提供重要參考和關鍵依據。
2.2 病原微生物檢測技術簡介
病原微生物檢測通常是對病人感染部位取樣檢查，判斷菌種。常用微生物檢查標本有血液、尿、痰、胸水、腹水、各種分泌物、各種穿刺液、灌洗液以及鼻咽/口咽拭子等。隨著醫學微生物學研究技術的不斷發展，病原微生物診斷已由傳統染色、培養等宏觀手段發展到以DNA、RNA和蛋白為對象的分子生物技術檢測方式。
2.2.1 傳統檢測方法
傳統病原微生物的檢測包括形態學檢查、分離培養以及免疫學方法三類。其中形態學檢查以及免疫學方法不需要進行病原體的分離培養。傳統檢測方法通過觀察病原體本身的形態特征、測定代謝物、測定生化反應及檢測病原體的抗原或抗體等手段，對菌種進行鑒定，測試其藥敏特征。在一般診療過程中，形態學檢查僅可用于初步判斷病原體大類，免疫學方法的檢測通量較低，而培養法是目前病原體檢測中的金標準，但具有耗時較長，過程相對復雜，對操作人員的技術要求較高等缺點。
2.2.1.1形態學檢查：涂片鏡檢
涂片精檢是一種將待檢樣品取材、制片后在顯微鏡下觀察、分析和判斷樣品中微生物種類的一種臨床診斷方法，通常用于疾病的初步判斷。人體的排泄物、分泌物或病患組織都可以作為檢查對象。常見的涂片鏡檢有革蘭氏染色法，可檢出革蘭氏陽性菌（如肺炎雙球菌、炭疽桿菌）、陰性菌（如百日咳桿菌、痢疾桿菌）。經過包括初染、媒染、脫色、復染等步驟后，革蘭氏陽性菌呈現紫色，革蘭氏陰性菌呈現紅色并且由于染色使得細菌的形態和結構特征更易于觀察，從而更利于分類鑒定。此外還有抗酸染色、芽孢染色、鞭毛染色等多種染色方式。通過染色或直接觀察，可根據菌體形態大致分為球菌（分散狀、成堆狀、鏈狀、成雙狀），桿菌（長桿菌、短桿菌、鏈桿菌、彎曲桿菌等），弧菌等類型。
2.2.1.2免疫學檢查
免疫學檢測是一種基于抗原抗體特異性結合反應原理的檢測方法， 將免疫反應與現代測試技術有機結合起來, 利用超微量的檢測形式, 實現病原的鑒定。既可以檢測病原菌的抗原，也可以檢測免疫細胞的抗體。抗原檢測可以確認病原菌，而抗體檢測則是預防檢測，健康評估的方法，兩者相輔相成。臨床上CRP檢測即屬于免疫檢測的一種。免疫檢測的靈敏度和特異性高，比傳統的檢測方法耗時減少。但病原體種類繁多，已研發的抗原、抗體數量遠遠不能滿足市場需求，且檢測結果很大程度上依賴于抗體的好壞，抗體制備、檢測操作過程較繁瑣，且抗體易受環境中各種物質和微生物的干擾，影響了它的廣泛應用，測定成本較高。
2.2.1.3 培養法
培養法是指根據盲樣檢測目標、盲樣性狀以及染色鏡檢等信息，選擇分離培養用培養基及增菌培養用培養基對樣本中的病原微生物進一步擴增及分離培養，用以后續生化檢測、鑒定病原體精確類型的方法。其具體步驟包括微生物培養及生化或其他類型的檢測兩部分。例如使用羅氏培養法診斷肺結核病。羅氏培養基可促進分枝桿菌的生長并抑制其他雜菌，經培養3-4周后分枝桿菌形成菌落，呈干燥顆粒狀，乳白色或米黃色，形似花菜心。目前臨床診斷上仍主要依賴于培養結果，但培養病原體過程耗時較長至少48～72小時，可能滯后于治療。同時臨床上常規僅能對部分細菌進行穩定培養，大多數病原微生物如肺炎鏈球菌等難以培養，真菌和病毒的培養往往很少使用，因此培養檢測結果陽性率不高。此外采樣或送檢過程中引入的外界污染有可能在培養過程中被進一步放大，出現假陽性的現象。
通過培養獲得濃度及純度相對較高的病原微生物之后，生化方法通過檢測微生物表達的特異性酶，對微生物種類進行鑒定。使用特定的底物，檢測微生物代謝底物的能力，即可判斷微生物是否具有某種特定的酶。例如檢測沙門氏菌的辛酯酶法。各屬腸桿菌科細菌中只有沙門氏菌表達辛酯酶，根據這一特性，甄宏太等開發了快速檢測沙門氏菌的辛酯酶法。該方法是以42甲基傘形酮辛酯（MUCAP）為底物，在沙門氏菌的酶促反應后，生成4MU，在紫外燈下可觀察到藍色熒光。該方法在數分鐘內即可完成，適合病菌的初步篩查。
目前臨床上針對培養樣本的生化檢測，已有較高通量的自動生化鑒定體系建立。全自動微生物生化鑒定系統是一種集生化反應、計算機和自動化技術于一體的檢測技術，具有速度快，通量高的優點。常見儀器如法國生物梅里埃公司的VITEK系統和美國BD公司的PHOENIX系統。自動化系統可進行多達幾十種的微量生化反應和藥敏生長試驗，根據各生化反應孔中的生長變化及呈色反應情況，由計算機通過數值編碼技術與數據庫進行比較分析，得到鑒定結果。