超多重PCR技術及其在臨床病原微生物檢測的應用（三）

2.2.2 基于分子的病原體檢測技術

2.2.2.1蛋白檢測

目前針對病原體蛋白的直接檢測使用質譜技術，基于已建立的微生物胞膜蛋白質、脂多糖、核酸等的數據庫對微生物進行精準鑒定和分析。質譜方法針對培養后濃度較高、品種較為單一的待測樣品，通過獲得其蛋白質圖譜，再與已知微生物構建的數據庫的參考圖譜進行比對，從而鑒定病原微生物。質譜檢測技術高效快速且成本低，加之其高靈敏度、高特異性和高準確性的特點，在臨床微生物檢測等方面獲得了廣泛的應用，用于多類型樣本中細菌和真菌的直接鑒定。但目前僅能處理培養后菌株等相對單純樣品，難以對原始臨床標本中復雜背景樣品進行病原檢測，檢測內容也僅限于病原體分型，在生物耐藥性分析和毒力研究等方面進展較少。

2.2.2.2核酸檢測

基于核酸的檢測早期使用PCR的方式，對病原微生物基因組或轉錄組片段進行特異性擴增，再對擴增片段進行鑒定或片段擴增進程進行分析，從而實現病原體的鑒定。

PCR技術的具體原理如上文所述，在病原微生物領域使用到的PCR衍生技術包括逆轉錄PCR(RT-PCR)（獲得RNA病毒的cDNA文庫并用以后續檢測）、半巢式和巢式聚合PCR (seminested PCR 和 nested PCR)、多重PCR（mPCR）以及多通道熒光定量PCR等。這些衍生技術有各自特點，能有效應用于環境病原體檢測。如巢式PCR。巢式PCR是常規PCR的一種演變，其增強了反應特異性和目標擴增子的產量。巢式PCR中設計有兩對引物：第一對（外引物）在目標擴增區域的側翼，這一對PCR引物擴增過程和普通PCR相似。而第二對引物（巢式引物）結合在第一次PCR產物內部，對應于所擴增DNA的準確區域，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。

與普通PCR相比，巢式PCR 克服了單次擴增平臺期效應的限制，使擴增倍數提高，從而極大的提高了PCR的敏感性。巢式引物擴增的模板是外側引物擴增的產物，第二階段反應能否進行，也是對第一階段反應正確性的鑒定，因引可以保證整個反應的準確性及可行性。對于是樣品中目的基因的表達豐度較低的情況下，巢式PCR的優勢突顯。但相比傳統PCR，巢式PCR在進行第二次擴增時引起交叉污染的幾率較大。巢式PCR檢測目標病原多為病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等。

多重PCR的引入增加了病原體的檢測通量，但市面上的多重PCR擴增大多基于細菌的16S或23S或真菌的18S。針對這一區域進行擴增，在設計引物時，不同種病原體的引物片段存在重疊，限制了多重PCR一次反應能夠特異性擴增的病原體數量，一般情況下很難實現超過30種特異性片段的同時擴增。

PCR特異性擴增后檢測是否存在特異性擴增片段以實現病原體的鑒定方面，可用的方法除了上文提到的電泳法，還包括熱熔曲線法、基因芯片等方式。

熱熔曲線法是在正常的PCR反應基礎上加一個溶解曲線的反應條件，溶解曲線分析可以用來確定不同的反應產物，包括非特異性產物。PCR擴增反應完成后，通過逐漸增加溫度同時監測每一步的熒光信號來產生溶解曲線.其中當溫度由60℃升至95℃時，PCR儀每隔一定的溫度檢測一次信號。最后將收集的信號繪制出溶解曲線。隨著反應中雙鏈DNA變性，熒光染料又回復到游離狀態導至熒光信號降低，用熒光信號改變的負的一次導數與溫度作圖，在擴增產物的溶解溫度上有一特征峰（Tm，DNA雙鏈解鏈50%的溫度，與不同DNA片段的堿基組成相關），用這個特征峰就可以將特異產物與其它產物如引物二聚體區分開，因為它們在不同的溫度溶解。每一條線代表著某個孔里的反應體系里產物的單一情況，某一條線如果為單峰且在一定合理的溫度范圍內（一般為80~90℃）則認為正常，如果為雙峰則可能有非特異性擴增。由此可以判斷產物是否為目的基因且是否單一。可以看出，該方法實際上檢測的是不同擴增片段DNA堿基所占比（GC比），因此僅能作為近似模擬，無法精準保證擴增片段一定是目的基因片段，對于病原體鑒定的精確度相對有限，同時穩定性依然有待提高。

總的來說，傳統病原學培養的遍耗時較長且存在一定的假陽性率。多種因素影響標本質量，從而影響培養結果的準確性，且絕大多數病原體不可培養。還有以PCR為基礎的分子診斷技術在敏感性、特異性和檢測時效上明顯優于培養法，但因為該法基于已知病原菌的基因序列進行定向檢測，在無法實現超多重PCR的前提下所能提供的信息有限，依然不能很有效地解決臨床診斷陽性率低的問題；除此之外，對于混合感染和未知致病微生物的檢測是傳統檢測方法無法逾越的障礙。據統計，超過1/3的復雜感染性疾病患者因傳統檢測方法無法確定病原體信息，不能得到及時有效地救治，從而使病情惡化。且如今疑難感染病例不斷增多，傳統診斷方法跟不上微生物進化和變異的節奏，傳染病的傳播速度明顯加快，而臨床檢測方法的局限常常導至錯誤用藥和延誤治療，故此盡快發展新的能滿足臨床需求的檢測方法刻不容緩。

表1.常規病原微生物檢測技術對比

圖4. mNGS檢測步驟(來源：Nature Reviews 2019)

mNGS檢測方法首先將微生物細胞的細胞壁、細胞膜打破，使基因組DNA釋放出來，然后根據DNA的特質，將其從結合的蛋白質中分離出來。得到純化的宏基因組DNA后，通過微量提取及建庫方法，制備病原體核酸文庫，并對其核酸序列進行高通量測序。mNGS的高通量測序方法先后有羅氏454焦磷酸測序技術、Illumina（Solexa測序技術）、SOLiD測序技術和Ion Torrent測序技術。目前市場上以Illumina（Solexa測序技術）為主，Ion Torrent測序技術為輔。高通量測序后將所得核酸序列與微生物專用數據庫中病原體標準序列進行同源性或序列特征比對分析，從而得到鑒定結果。這種方法不依賴于細菌培養，從取樣，核酸提取及建庫到測序、生信分析及報告時間僅需約24小時，且可同時檢測理論上所有已完成基因組測序的病原體，具有十分強大的檢測性能。

mNGS 對膿毒癥、重癥肺部感染等嚴重感染具有較高的臨床應用價值，能快速、精準地找到病原體并對抗菌藥物治療方案的制定和治療效果的評估有一定的指導作用。目前mNGS技術已逐步用于臨床疑難感染診斷，203年C.Y.Chiu 教授首次成功應用mNGS技術為一位不明原因發熱的男孩確診為鉤端螺旋體腦炎。2014年中國協和醫院關鴻志教授用mNGS確診了人類皰疹病毒腦炎。2016年深圳第三醫院用mNGS技術確診了一例罕見阿米巴腦炎。2017年中國華山醫院張文宏教授應用mNGS技術先后確診了跨物種傳播的狂犬病毒以及錐蟲感染等，并給與針性治療使患者痊愈。這些成功案例無一不預示著mNGS技術在生物監測領域上廣闊的發展前景。

盡管mNGS 用于臨床病原診斷具有諸多優勢，但其技術仍然面臨著一些挑戰。例如，在測序中真正有意義的基因片段比例較低。采樣時樣本難以完全排除人源細胞，而人類基因組的大小（3Gb）遠大于細菌的基因組（3Mb）。當人源細胞和細菌數量為1：1時，測序信號中人源基因片段數量與細菌基因片段高達2000：1，這意味著目標基因片段在整體樣本中的含量較低，會導至檢測成本整體偏高，并可能會出現目標基因片段太小而致使無法明確檢測病原種屬的可能。在臨床應用上，mNGS技術還存在一些目前難以解決的問題：

1. 難以mNGS技術檢出的病原體只能代表標本中存在這些檢出微生物，無法具體確定是定植菌、背景菌還是致病菌。

2. mNGS技術對于胞內菌、真菌兩類微生物檢測敏感性較低：由于測序成本的限制，mNGS需盡量排除人源細胞的干擾。因此針對胞內感染菌如結核分枝桿菌、軍團菌等，由于其在體液內密度較低而導至檢測敏感性偏低；同時mNGS對于具有較厚細胞壁的病原體及真菌核酸提取效率較低，導至檢出率和敏感性較低。

3.  mNGS檢測技術對RNA病毒檢測難度大：RNA轉錄本身有更高的豐度和復雜度，又容易降解，對運輸和保存的要求較高，因此RNA病毒的臨床檢測還存在一定的困難。

4. 在耐藥檢測上，目前使用 mNGS 進行耐藥基因檢測還存在一定的困難。現有檢測方法因成本考慮導至耐藥相關基因覆蓋度較低，難以高靈敏度地檢測出相關耐藥基因。

5.從測序結果的可靠程度來講，不同的公司，對于可靠程度的數據采用不同的報告方法，如深度、覆蓋度、豐度、估測濃度、置信度，各有千秋，尚無統一標準；同一公司相同樣本測序報告結果的穩定性同樣也是需要更進一步提升的因素。

2.2.3.2 tNGS法病原體檢測的操作流程及優勢分析

針對mNGS方法在臨床上檢測靈敏度和成本的諸多問題，tNGS可在增加樣本中病原微生物信息、提高靈敏度的前提下大大減少測序數據量，從而實現性能及成本的雙重優化。總的來說，tNGS 檢測包括以下幾個主要步驟：

1.  采集臨床樣本并進行核酸抽提，針對RNA病毒進行檢測還需補充反轉錄獲得cDNA這一步驟；

2.  PCR靶向擴增，設計針對感興趣病原微生物基因片段的特異性引物，靶向擴增相關序列。這一步可實現信號放大的目的，同時由于人源基因、定植菌基因及其他背景基因片段并未擴增，因此有效地排除了背景DNA對于后續NGS的影響；

3.  第二輪PCR反應并進行NGS 建庫，

4.  PCR產物質量檢測及NGS測序

5.  生信分析和檢測報告