在使用高效液相色譜儀的過程中，我們需要注意哪些問題呢？今天將相關內容做一匯總，以饗各位小伙伴~
液相色譜儀使用操作規程
液相色譜儀使用操作規程總流程：
超純水沖洗柱——流動相分離樣品——超純水沖洗柱 ——純乙睛保存柱
1． 電源準備
打開穩壓器電源開關，須待電壓指示至 220V 后，才能開啟其他有關設備。
2． HP1100 高效液相色譜儀的準備
試劑：三氟乙酸
乙腈(Fisher 公司產品色譜純)
超純水(Millipore 超純水)
冰乙酸
溶液配置：貯液瓶與流動相的準備
A 液 0.1%三氟乙酸 （三氟乙酸 1ml，超純水 999ml）室溫保存
B 液 60%乙腈 （乙腈 600ml， 超純水 400ml）室溫保存
樣品液 0.01%乙酸 （冰乙酸0.01ml，超純水 100ml）室溫保存
泵頭沖洗液：精濾后超純水或者是 1%色譜純甲醇 室溫保存
注：貯液瓶應用超純水清洗干凈，備用。
流動相溶劑用潔凈硼砂漏斗精濾除去微小顆粒。
操作者必須清楚并注明 A、B 貯液瓶盛裝為何種溶劑。
沖 洗 泵 頭 ： 用 注 射 管 于 軟 塑 料 管 末 端 抽 吸 至 有 水 流 出 ， 調 節 流 速 開 關 控 制 流 速 為20-30drop/min.。
① 流動相管道排氣
如果管道中氣泡較多，可通過彈擊管道，排除氣泡，并逆時針旋轉脫氣泵活塞使其松動，用注射管于流動相出口的塑料管末端抽吸至管道內氣泡排除完全。操作時，我們通常已經打開了脫氣機（氣泡嚴重影響分離效果，所以觀察管道中液體是否有氣泡非常重要。）
② 開機
③ 進入 HP1100 操作系統
a.雙擊 WIN-95 操作界面中左下角 Instrument 1 online 圖標，進入 HP1100 工作站軟件操作界面。單擊工作站操作界面上方 Run control 菜單，在下拉菜單中找到 Sample Info 子菜單，單擊。在 Sample Info 信息框內定義操作者、樣品前綴及編號、保存路徑等參數。在保存路徑項下，將可定義子目錄分別輸入操作者拼音縮寫，以方便檢索時互不干擾。
b.等待工作站操作界面中泵、柱溫箱、檢測器各指示圖標由灰色轉變為綠色后，單擊泵、檢測器各圖標可從其各自彈出的菜單中設定流動相各溶劑比例、流速等。
（1） 流速通常為 1ml/min。檢測波長通常為 280，或者 254nm。
（2） A 液設置為 100%，運行 15-30 分鐘（目的是色譜柱的預平衡），觀察基線走勢，基線應為直線，通過單擊“Balance”鍵可將基線調至零點。待基線平穩后可進樣。
（3） 調整 A 液為 0，B 液為 100%再運行 60 分鐘（此時乙腈實際濃度為 60%）
（4） 在 A 液沖洗同時進行進樣環的沖洗：用 500μl 的針樣注射器，在 load 狀態，注入超純水 500μl。（反復三次，若是 20μl 進樣環，則加入 20μl 以上，多余的水可廢液管流出。通常同一樣品上樣 30 次后應沖洗進樣環，如果不同樣品，最好，每次上樣前均進行沖洗。）
（5） 吸取一定量可直接進樣的樣品溶液（上樣液最好用濾器濾過），將進樣閥逆時針旋至Load 檔，將進樣針從進樣孔處水平推入，按進樣器活塞將樣品溶液注射入進樣環后，立即將進樣閥順時針方向旋至 Inject 檔，與此同時，數據開始自動收集。
（6） 此時樣品分析已經完成。在 HP1100 主操作界面的檢測器圖標，關閉檢測器，然后關閉色譜儀主機檢測器開關（目的是延長檢測器壽命）。將 B 通道調為 0，A 通道調為 100%，即 A 液沖洗色譜柱約 10-30min。用 A 液續沖洗色譜柱約 10-30m（目的是沖出柱內殘留的雜質）
（7） A 通道換為 C 通道（100%乙腈）續沖洗色柱約 10-30min。（目的主要為保護柱）
④ 數據記錄的終止與保存
電腦將自動收集并保存數據，終止運行后，將自動彈出數據框，或者可通過 DATA ANALYSIS菜單，調出資料。
3． 圖譜處理
4． 關機
1） HP1100 的關閉
在 HP1100 的主操作界面上分別單擊關閉泵、檢測器圖標，或通過菜單關閉 。然后，單擊HP1100 的主操作界面右上方“X”，退出 Instrument 1 online 程序，返回至 WIN-95 操作界面。單擊左下角“Start”菜單，單擊“Shut down”,等待關機，待出現“Restart”提示后，按電腦主機電源鍵，關閉電腦主機及顯示器。將所有使用儀器用布蓋好。關閉排氣扇、空調與穩壓器開關。
2） 清潔衛生
實驗完畢后，打掃儀器室桌面與地面清潔，保持桌面整潔。
3） 儀器使用記錄
記錄當天的儀器使用情況于指定記錄本上，包括儀器使用起止時間與出現問題的解決方案，并簽上操作者的名字。
島津液相色譜儀使用注意事項
流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質和其他物質(使用0.45um或更細的膜過濾)。
流動相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應該恢復到室溫后使用。
不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導致泵不進液。
使用緩沖溶液時，做完樣品后應立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上。
長時間不用儀器，應該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應該用有機相(如甲醇等)，因為純水易長霉。
每次做完樣品后應該用溶解樣品的溶劑清洗進樣器。
C18柱絕對不能進蛋白樣品，血樣、生物樣品。
堵塞導致壓力太大，按預柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查并清洗。清洗方法；①以異丙醇作溶劑沖洗：②放在異丙醇中間用超聲波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。
氣泡會致使壓力不穩，重現性差，所以在使用過程中要盡量避免產生氣泡。
如果進液管內不進液體時，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進行流動相的清洗。
要注意柱子的pH值范圍，不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品。
更換流動相時應該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動邊靖洗，然后插入新的流動相中。更換無互溶性的流動相時要用異丙醇過渡一下。
流動相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。
b、流動相具有一定惰性，與樣品不產生化學反應(特殊情況除外)。
c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。
f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。
流動相流速的選擇： 因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。 當選用最佳流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。 注意：
a．由于甲醇廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。
b．對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質，有可能影響分析結果。
c．含水流動相最好在臨實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細菌生長。
d．流動相要求使用0.45 ?0?8m濾膜過濾，除去微粒雜質。
e．使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
常見故障斷定及解決辦法
(一)保留時間變化
1.柱溫變化 柱恒溫，必要時需配置恒溫箱
2.等度與梯度間未能充分平衡 至少用10倍柱體積的流動相平衡柱
3.緩沖液容量不夠用 》25mmol/L的緩沖液
4.柱污染 每天沖洗柱
5.柱內條件變化 穩定進樣條件,調節流動相
6.柱快達到壽命 采用保護柱
(二)保留時間縮短
1.流速增加 檢查泵,重新設定流速
2.樣品超載 降低樣品量
3.鍵合相流失 流動相pH值保持在3~7.5，檢查柱的方向
4.流動相組成變化 防止流動相蒸發或沉淀
5.溫度增加 柱恒溫
(三)保留時間延長
1.流速下降 管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內氣泡
2.硅膠柱上活性點變化 用流動相改性劑,如加三乙胺,或采用堿質鈍化柱
3.鍵合相流失 同前(二)3
4.流動相組成變化 同前(二)4
5.溫度降低 同前(二)5
(四) 出現肩峰或分叉
1.樣品體積過大 用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%
2.樣品溶劑過強 采用較弱的樣品溶劑
3.柱塌陷或形成短路通道 更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件
4.柱內燒結不銹鋼失效 更換燒結不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品
5.進樣器損壞 更換進樣器轉子
(五)鬼峰
1.進樣閥殘余峰 每次用后用強溶劑清洗閥,改進閥和樣品的清洗
2.樣品中未知物 處理樣品
3.柱未平衡 重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑 (尤其是離子對色譜)
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜) 每天新配,用抗氧化劑
5.水污染(反相) 通過變化平衡時間檢查水質量，用HPLC級的水
(六) 基線噪聲
1.氣泡(尖銳峰) 流動相脫氣,加柱后背壓
2.污染(隨機噪聲) 清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑
3.檢測器燈連續噪聲 更換氘燈
4.電干擾(偶然噪聲) 采用穩壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等)
5.檢測器中有氣泡 流動相脫氣,加柱后背壓
(七)峰拖尾
1.柱超載 降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相
2.峰干擾 清潔樣品,調整流動相
3.硅羥基作用 加三乙胺,用堿質鈍化柱，增加緩沖液或鹽的濃度，降低流動相pH值，鈍化樣品
4.同前(四)4 同前(四)4
5.同前(四)3 5.同前(四)3
6.死體積或柱外體積過大 連接點降至最低,對所有連接點作合適調整,盡可能采用細內徑的連接管
7.柱效下降 用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護柱
(八)峰展寬
1.進樣體積過大 同(四)1
2.在進樣閥中造成峰擴展 進樣前后排出氣泡以降低擴散
3.數據系統采樣速率太慢 設定速率應是每峰大于10點
4.檢測器時間常數過大 設定時間常數為感興趣第一峰半寬的10%
5.流動相粘度過高 增加柱溫,采用低粘度流動相
6.檢測池體積過大 用小體積池,卸下熱交換器
7.保留時間過長 等度洗脫時增加溶劑含量也可用梯度洗脫
8.柱外體積過大 將連接管徑和連接管長度降至最小
9.樣品過載 進小濃度小體積樣品
液相色譜儀的使用及維護
液相色譜儀使用時要非常注意。使用卡套柱時，兩端的卡套應時刻連接在柱芯上。不管您是平衡色譜柱或是清洗，任何時候都不能將卡套取下來，否則會造成填料的流失。
液相色譜柱使用注意：
◇卡套柱的安裝（加預柱）
1．將卡套架套入柱芯
2．將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使夾套高于柱芯（見下圖）
3．將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過夾套片
4．將"子彈頭"預柱放入卡套片內
5．將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手擰緊
6．然后依同樣的順序連接好柱子的另一端
◇平衡色譜柱
反相色譜柱在經過出廠測試后是保存在乙腈/水中的。請一定確保您所使用的流動相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲存或運輸過程中可能會干掉，因此在用流動相分析樣品之前，應使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果您所使用的流動相中含有緩沖鹽，應注意用純水"過渡"。
硅膠柱或極性色譜柱在經過出廠測試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水的流動相，請在使用流動相之前用乙醇或異丙醇平衡
◇如何平衡色譜柱？
平衡過程中，將流速緩慢地提高用流動相平衡色譜柱直到獲得穩定的基線（緩沖鹽或離子對試劑度如果較低，則需要較長的時間來平衡）
◇色譜柱的再生
進行色譜柱再生時，應使用一個廉價的泵，我們建議最好不使用您的高效液相色譜儀上的泵。
◇注意：
在對NH2改性的色譜柱進行再生時，由于NH2可能成銨根離子的形式存在，因此應該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。 如果簡單的有機溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質，用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。
色譜柱的維護
1．使用預柱保護分析柱（硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度）
2．大多數反相色譜柱的pH穩定范圍是2－7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍
3．避免流動相組成及極性的劇烈變化
4．流動相使用前必須經脫氣和過濾處理
5．如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應在實驗完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇/乙腈中
6．壓力升高是需要更換預柱的信號
液相色譜的常用術語
1、色譜曲線chromatogram）：在色譜法中，當樣品加入后，樣品中各組分隨著流動相的不斷向前移動而在兩相間反復進行溶解、揮發，或 吸附、解吸的過程。如果各組分在固定相中的分配系數（表示溶解或吸附的能力）不同，就有可能達到分離。
分配系數小的組分滯留在固定相中的時間短，在柱內移動的速度快，先流出柱子；分配系數大的組分滯留在固定相中的時間長，在柱內移動的速度慢，后流出柱子；分離后的各組分經檢測器轉換成電信號而記錄下來，得到一條信號隨時間變化的曲線，稱為色譜流出曲線或 “色譜峰”，理想的色譜流出曲線應該是正態分布曲線。
2、（色譜）峰（chromatographic peak）：色譜柱流出組分通過檢測器系統時所產生的響應信號的微分曲線。
3、峰底（peak base）：峰的起點與終點之間的連接的直線。
4、峰高（h ，peak height）：色譜峰最大值點到峰底的距離。
5、峰寬（W ，peak width）：在峰兩側拐點處所作切線與峰底相交兩點的距離。
6、半高峰寬（W h/2 ，peak withd at half height）：通過峰高的中點作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側相交兩點之間的距離。
7、峰面積（A ，peak area）：峰與峰底之間的面積。
8、拖尾峰（tailing peak）：后沿較前沿平緩的不對稱的峰。
9、前伸峰（leading peak）：前沿較后沿平緩的不對稱的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）
10、假峰（ghost peak）：除組分正常產生的色譜峰外，由于儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現的色譜峰，即并非由試樣所產生的峰。這種色譜峰并不代表具體某一組分，容易給定性、定量帶來誤差。（又叫鬼峰）
11、畸峰（distrorted peak）：形狀不對稱的色譜峰， 前伸峰、拖尾峰都屬于這類。
12、反峰（negative peak）：也稱倒峰、負峰，即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰。
柱的使用和維護注意事項
色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。
① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩（如前所述）。
②應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。
③ 一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
④ 選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
⑥ 經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50~75ml。
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質，在甲醇（乙腈）沖洗時重復注射100~200?0?8l四氫呋喃數次有助于除去強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質污染。陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）、甲醇、水依次沖洗。
⑦ 保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。
⑧ 色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。在后兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼勺將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。 通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質的填料，只能在pH2~9范圍內使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質保留于柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。每次工作完后，最好用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4~5天開機沖洗15分鐘。