感染性疾病診斷中POCT的應用

近年來，感染性疾病的新發突發不斷威脅人類健康，新型冠狀病毒肺炎、中東呼吸綜合征、流感、埃博拉、寨卡病毒、黃熱病、裂谷熱等傳染性疾病的傳播，成為全球公共衛生問題。隨著城市化的發展、全球貿易往來的增加，環境改變加劇自然疫源性傳染病的傳播風險，感染性疾病的預防控制刻不容緩。因此，開展傳染病的即時快速檢測，對于感染性疾病的防控工作具有重大意義。

1995年美國CLSI提出即時檢測（point-of-care testing，POCT）的概念，1995年美國臨床化學學會（American Association for Clinical Chemistry，AACC）年會展覽展出了一些能夠快捷移動、操作簡便、結果準確可靠的技術和設備，即"在靠近患者的地方在極短的時間內以混合型實驗室的形式獲得準確測量結果的裝置與儀器"，即POCT設備。POCT也可以被解釋為靠近患者的床旁檢測，醫生、護士甚至患者都可以操作，快速的現場檢測避免了標本采集送檢的過多流程，縮短了發現傳染病的時間，促進藥物早期合理使用，從而實現傳染病的早期防治目標。

一、POCT的發展

POCT具有操作簡便、便攜、智能化等優點，近年來作為體外診斷技術發展迅速，被應用在多個學科的檢測項目中。在感染性疾病檢測中，POCT也已經成為十分重要的檢測技術，檢測項目廣泛，除了常見的CRP、降鈣素原、白介素-6等細胞因子的快速檢測，還包括各種細菌、病毒等多種病原微生物的檢測。

隨著生物醫學技術的發展，干化學技術、免疫層析技術、色譜、光譜、生物傳感器及光電分析技術、計算機芯片技術、自動化技術等的應用以及免疫和分子生物技術的引進，POCT呈現出自動化和簡單化的趨勢，在臨床和社區醫療中發揮著重要的作用。POCT所應用的技術原理正在從傳統的干化學技術、免疫層析技術等向生物傳感技術、微流控芯片技術等發展。

二、POCT技術在感染性疾病診斷的應用

（一）免疫學檢測

POCT應用的免疫學技術主要是膠體金免疫層析技術、免疫熒光技術、（電）化學技術、乳膠標記技術等，主要應用于病原體的抗原和抗體檢測，病原體刺激機體產生細胞因子的檢測，快速時相反應蛋白檢測和代謝產物毒素檢測等。

1．膠體金技術在病原體抗原抗體檢測中的應用：

目前在臨床檢測中最常見的是膠體金檢測。膠體金免疫層析技術是以免疫層析技術、膠體金標記技術相結合的一種新型免疫學技術，其特點是單份測定、簡單快速，幾分鐘即可用肉眼觀察結果。該方法的優點是簡單、快速、及時，缺點是靈敏度低，容易漏檢。膠體金法能夠直接檢測傳染病病原的抗原和抗體。

臨床應用較廣的POCT抗原檢測包括：甲乙型流感抗原、呼吸道合胞病毒抗原（鼻咽部分泌物）、軍團菌抗原（尿）、隱球菌抗原、惡性瘧原蟲循環抗原和間日瘧原蟲抗原、班氏絲蟲抗原及利什曼原蟲抗原的檢測等。

POCT抗體檢測包括術前篩查項目[艾滋病病毒抗體（1+2）、梅毒螺旋體抗體、乙肝五項、丙肝抗體、乙型肝炎病毒表面抗原]，腎綜合征出血熱病毒抗體、乙型腦炎血清特異性抗體、單純皰疹病毒抗體、人巨細胞病毒IgM抗體、風疹病毒抗體、輪狀病毒抗體（糞便）、登革熱病毒抗體、淋球菌（分泌物）和泌尿生殖系沙眼衣原體（分泌物）、沙門菌血清抗體、抗幽門螺桿菌細胞毒素相關蛋白A抗體等，還能夠檢測弓形蟲抗體、包蟲體抗體、血吸蟲抗體、人囊蟲病等。

2．膠體金法在感染性疾病炎性指標中的應用：

急性感染時膠體金法檢測CRP、降鈣素原、血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A protein，SAA）、白介素-6等。在診斷細菌或病毒感染時更加簡便快速，能夠滿足臨床即時檢測需求。SAA是細菌和病毒感染密切相關的標志物，其在判斷感染特別是病毒感染方面明顯優于CRP和WBC，可作為早期感染的判別標志物。病毒感染后，SAA上升的幅度與病毒種類有關，SAA聯合CRP和WBC檢測能夠提高細菌或病毒感染診斷的可靠性。

3．其他POCT技術在感染性疾病免疫學檢測中的應用：

免疫熒光技術分為直接免疫熒光和間接免疫熒光技術兩類，主要應用于呼吸道病原體的抗原和抗體檢測，其優點是直接在熒光顯微鏡下看到病原體，缺點是檢測時間長，需要熒光顯微鏡，要求人員有一定的形態學辨識能力。

電化學技術應用于POCT病原體檢測，優點是檢測病原體項目多（弓形蟲抗體、風疹病毒抗體、巨細胞病毒抗體、單純皰疹病毒抗體等），靈敏度高。缺點是特殊人群假陽性率高（孕婦）。

乳膠標記技術主要應用于病原體的抗原和抗體檢測，例如狂犬病、日本乙型腦炎、隱球菌抗原等，其優點是快速，缺點是假陽性率高，容易發生非特異反應。

（二）病原體核酸檢測

1．微流控芯片技術：

1990年微型全分析系統（miniaturized total analysis system，μTAS）的概念提出之后，微流控芯片是μTAS中當前最活躍的領域和發展前沿，它將分析實驗室功能轉移到芯片上，即芯片實驗室（lab-on-a-chip，LOC）。

微流控芯片技術可將化學和生物等領域中涉及的樣品制備、反應、分析、檢測等基本操作單元集成到一塊幾平方厘米的芯上，具有試劑樣品用量少、分析速度快的優點，用于床旁檢驗已受到廣泛關注。微流控芯片將核酸提取、擴增以及檢測整合到微流控芯片上，降低了檢測的復雜性，是目前絕大多數核酸POCT所采用的技術平臺。

微流控芯片在病原體檢測的應用，臨床采用Roche Cobas Liat系統，檢測包括A/B型流感、A群鏈球菌和A/B型流感加呼吸道合胞病毒，只需要15~20 min。利用微流控芯片擴增EB病毒，僅需0.5 μl樣品，反應體積僅需1 μl，靈敏度為3×105拷貝/ml。

Cooper等實現了白色念珠菌的快速分離檢測，相對于傳統的微生物真菌培養需要幾天的時間鑒定，該檢測僅需3 h就可檢出血液中低至1個/ml的病原菌，使感染者能夠及時得到恰當的救治，提高患者生存率，希望隨著技術的改進，繼續縮短檢測時間。檢測HIV病毒，每張微流控芯片可同時檢測7份樣本，整個檢測過程在20 min內完成，且準確率達100%。

微流控芯片技術不僅檢測速度快，而且操作簡單，將含蠟樣芽胞桿菌的標本加入微流控芯片后，裝置自動完成整個檢測流程，檢測靈敏度為細胞103~104個/ml。感染性疾病的分子診斷相對于細菌培養方法，在靈敏度、快速等方面均有顯著優勢，目前微流控生物傳感器對感染性疾病的檢測已實現了多樣品來源如唾液、口腔上皮細胞、血漿等，檢測種類涵蓋多種細菌、真菌、病毒檢測。

Oblath等將除核酸提取步驟外的一整套檢測流程整合到微流控芯片上，并利用氧化鋁薄膜為實時PCR擴增過程提供溫度循環條件，實現唾液中多種口腔鏈球菌的分型檢測，快速準確，檢測靈敏度為8~12拷貝/μl。Cepheid公司的Xpert檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）對比常規細菌培養方法，大大地縮短了陰性結果的周轉時間，靈敏度和特異度都大大提高。

Xpert MTB/RIF可以直接從原始痰標本中快速、敏感地檢出結核分枝桿菌及利福平耐藥性。WHO認可并推薦Xpert MTB/RIF在結核病防治規劃中的應用。在非洲進行的一項多中心、隨機、對照試驗評估了Xpert MTB/RIF即時檢驗對結核病的可行性、準確性和臨床療效，結果顯示Xpert MTB/RIF可以在初級保健機構由護士準確操作，由此可使更多的患者當天就開始治療，以縮短開始治療的時間。

核酸檢測的微流控芯片也在朝著高通量方向發展，一次檢測可以完成多種微生物鑒定、多種藥物敏感基因的分型。基于微流控技術實現人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）基因分型，能檢測和識別17個HPV高危型和7個HPV低危型。檢測限103拷貝數/L，某些型別甚至更低。

法國梅里埃Filmarray檢測平臺，能夠在單次反應中對多種病原體核酸進行檢測，具有很高的靈敏度和特異度，幫助醫生對患者感染及早診斷和正確用藥。該產品目前具有上呼吸道感染（19種病毒和3種細菌）、胃腸道感染（13種細菌、5種病毒和4種寄生蟲）和腦膜炎/腦炎（6種細菌、7種病毒和1種真菌）等多種病原檢測試劑盒。

2．微流控芯片聯合等溫擴增技術：

將核酸擴增與微流控芯片技術聯用開展POCT檢測，但是如果現場檢測儀器不具備溫控系統則很難應用于POCT檢測，而整合環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）可在恒溫條件下實現快速擴增，操作簡便快捷，更便于現場使用。

在DNA病毒檢測方面，Cai等采用逆轉錄LAMP檢測乙肝病毒，并采用常規分子生物學方法評價該法性能，檢出限為210 IU/ml。在RNA病毒檢測方面，Kurosaki等建立了逆轉錄LAMP法檢測馬爾堡病毒，靈敏度可達102拷貝/μl，該法可在40 min內檢測出馬爾堡病毒。

Kurosaki等建立的針對扎伊爾型埃博拉病毒的檢測逆轉錄LAMP方法，在26 min內即可檢測出20拷貝/μl的扎伊爾型埃博拉病毒，同時特異性較高，與親緣性較近的病毒核酸序列（如蘇丹型埃博拉和馬爾堡病毒等）沒有交叉反應。在細菌檢測方面，采用LAMP技術檢測結核分枝桿菌的試劑盒面市，該試劑盒檢測陽性痰液中結核菌的靈敏度為98.2%，直接檢測肺結核陽性患者的診斷靈敏度為88.2%，整個檢測過程在1 h內完成，并且操作簡便，為基層POCT檢測提供了方便。

因此整合LAMP和微流控技術，以可控流體貫穿反應過程，將多個操作平臺集成在一張芯片上，具有集成化和微型化的優勢。

Alere流感A/B測試使用等溫擴增和分子信標探針技術，5 min完成鼻拭子標本的流感病毒A/B檢測。基于微流控等溫擴增技術的甲型H1N1流感病毒檢測，反應體系3 μl，可在30 min內完成檢測，最低檢測限可達10拷貝/μl。Ma等設計了一個集成、自驅動的微流控芯片用于數字LAMP反應，整個檢測過程可以通過毛細作用力在芯片上自動完成，30 min對耐萬古霉素腸球菌菌株特異性基因進行擴增，檢測限僅為11個拷貝/μl。

3．納米孔測序技術：

納米孔測序技術也被公認為未來測序發展的一大方向。與以往的測序技術皆有不同，它不是通過檢測光、熒光信號顏色或pH來實現堿基序列的讀取，而是基于電信號的測序技術。蛋白質納米孔（微型的小孔，其本質是在膜上形成通道）被嵌入在合成膜上，并浸沒在電生理溶液中，使離子電流通過納米孔。

在像DNA或RNA這樣的分子通過納米孔時，會對電流帶來干擾，引起電流信號的特征性改變。在此過程中，信號被實時分析，用來確定正在通過該孔的DNA或RNA鏈的堿基序列。納米孔會分析通過它的整個DNA或RNA片段。

因此，在納米孔測序中，讀長長度與制備樣本中DNA或RNA的長度一致。用戶可以根據他們想要的實驗結果來選擇恰當的樣品制備方法，生成最適合的讀長長度。目前，使用標準的DNA提取方法已能夠獲得數萬到數十萬堿基的讀長，而由納米孔社區用戶設計的溫和提取法已獲得了超過2 000 000 bp的讀長。

納米孔技術提供的是動態、實時的測序，支持在幾分鐘內就獲得病原體鑒定等時間關鍵型應用的檢測結果。用戶可以在測序早期了解樣本的質量和狀態，也可以在獲得足夠的數據后停止測序。

未來，快速的采樣到結果周轉時間在感染性疾病、實地動態監測疫情暴發以及其他診斷方面具有巨大潛力。Kafetzopoulou等報道拉沙熱暴發，納米孔測序儀對36個基因組測序，拉沙熱病毒與前一年病原體存在系統發育混交，表明存在獨立的人畜共患的風險。

三、POCT技術在感染性疾病診斷應用中的局限性

在POCT帶來便捷快速的檢測方式的同時，在感染性疾病病原體檢測中還存在幾個問題。

首先，缺乏適宜的校準物質和質控品、質控不規范。準確性評價標準各異，導致其檢測的溯源性和可比性差，缺乏實用的標準。目前只有針對血糖、血氣、凝血方面的POCT管理指南，沒有感染病疾病快速診斷的管理指南，需要建立一個系統、完善的質量控制體系，減少POCT設備的檢驗結果與常規實驗室的誤差，保證準確性。

其次，廠家多、試劑雜，由于受檢測方法、樣本類型及人員操作等因素影響，結果不一致。雖然POCT操作簡單，但對POCT操作人員進行培訓，建立一個較為客觀的操作標準和評判指標，會提高結果的準確性。

第三，國內缺乏衛生經濟學評價，加拿大藥物和技術衛生機構報道檢測丙型肝炎病毒不同策略的檢測成本，在OraQuick定性檢測和實驗室常規核酸定量檢測之間，人均成本是相似的，約30美元。

第四，POCT核酸的結果應考慮個體內生物變異的存在，病原體核酸定量檢測結果可能在一定的范圍內波動，但對患者病情判斷無影響。如果可能，應在定量檢測的結果報告中加入變異范圍，如HIV-1病毒載量的變異容許限為<0.5 Log，HCV病毒載量的變異容許限為<1 Log。必要時需標注檢測可能的局限性，以及可能會影響結果判讀和應用的因素。

實驗室應記錄并保存關于每個標本檢測情況的充分信息，并應根據相關的法律法規和相應的管理規定對具有重要意義的傳染病（如人類免疫缺陷綜合征、埃博拉病毒等新發突發傳染病、肺結核等）的診斷，及時與負責的臨床醫師溝通并備案，同時注意保護患者的醫療信息。

第五，結合患者的疾病分期，進行相應POCT檢測，例如黃熱病的病毒血癥期是一過性的，在病毒血癥期檢測血中黃熱病毒核酸呈現陽性，但在恢復期血中黃熱病毒核酸呈現陰性，尿中黃熱病毒核酸為陽性。在男性感染寨卡病毒6個月后的精液中仍然能夠檢測到寨卡病毒的核酸。

四、展望

感染性疾病的快速診斷是當前POCT技術應用的熱點，比起傳統病原學檢測方法，POCT在診斷上更加快速和靈敏。POCT是初級衛生保健機構提供給患者的快速檢測手段，常用的檢測平臺是測流免疫方法。最近，新興的分子診斷技術滿足了POCT檢測速度，低成本的特點。

POCT分子檢測方法縮短樣本檢測時間，并能保證高特異性和敏感性，在現有基礎上，開發出針對各種感染性疾病的診斷試劑和儀器，仍將是POCT技術的開發重點。需要聯合多學科協作，研發國產的有自主知識產權的一體化的便攜式分子POCT檢測設備，實現多通道和自動化檢測，提高其現場適用性。隨著分析技術融入更多的先進科技，POCT正朝著互聯網整合模式發展，逐漸實現智能化、共享化、云端化，從而推動遠程醫療的發展，實現個性化的服務。