2019新型冠狀病毒于2020年1月12日被世界衛生組織（WHO）命名為2019-nCoV。2020年3月13日，世衛組織將2019冠狀病毒疫情從流行病升級為全球大流行病，疫情已在全球廣泛傳播。
隨著分子生物學技術的發展，分子診斷方法成為病原體檢測的一項革命性技術。我國在此次疫情爆發之初，就將核酸檢測產品及時應用到了疫情防控之中，是新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)病例確診的金標準。然而隨著核酸檢測方法的廣泛應用，不斷出現的核酸檢測假陰性率較高的質疑也成為媒體關注熱點。臨床學者從標本采集、檢測方法、產品穩定性等多方面剖析產生假陰性的可能原因[1]。隨著科研人員對新冠病毒基因組的解析，我們對新冠RT-PCR核酸檢測試劑的檢測性能與其基因組結果特征之間的關聯性進行了解析。
2019-nCoV為單股正鏈RNA病毒，基因組長29.8kb，病毒基因組全長的三分之二是開放性讀碼框（ORF）。2019-nCoV主要由結構蛋白和非結構蛋白組成，結構蛋白包括E基因編碼的包膜蛋白、M基因編碼的膜蛋白、N基因編碼的核衣殼蛋白、S基因編碼的刺突樣糖蛋白[2]。
國家藥監局應急批準的30個新型冠狀病毒檢測產品中核酸檢測試劑19個。
國家衛生健康委臨床檢驗中心《新型冠狀病毒核酸檢測室間質量評價結果報告》顯示，當前應用最廣泛的核酸檢測方法是熒光定量PCR法，而獲批的實時熒光定量PCR法試劑盒檢測靶標主要針對新冠病毒基因組開放性讀碼框ORF1ab、N基因、E基因保守區域進行引物設計。
１、病毒突變對檢測試劑性能的可能影響
前期的研究結果顯示新冠病毒傳播過程中發生了大量廣泛的單核苷酸變異，在最新的李蘭娟[3]院士團隊的研究結果表明，在對收治的11名新冠病毒感染患者體內分離到的新冠病毒進行了病毒突變情況分析后，統計發現有7株在ORF1ab區域產生12個突變，有2株在N基因區域產生3個突變。核酸檢測試劑的引物設計雖通常位于病毒基因組序列的保守區，但經過分析比對發現已知的這些突變不在現有試劑引物相應位置及核酸檢測靶標部位。越來越多的病毒基因組變異情況得到證實，那么在進化保守區域是否存在在進化上的保守區域的突變還未可知，若突變位置發生在病毒
RNA的引物設計區域，則可能直接導致檢測結果的假陰性。
另一方面，病毒突變也可能對抗體檢測產生影響。此項研究同時發現，分離到的11株病毒中在S基因區域有8個毒株產生10個突變，其中一個毒株在S基因區域的突變導致氨基酸發生了改變，而氨基酸變異可能導致其蛋白構象發生改變，且S蛋白是新冠病毒與宿主細胞表面受體結合的主要蛋白。由于結構蛋白發生變異導致患者體內產生針對突變S蛋白的抗體，那么就可能導致現在針對未突變S蛋白的抗體檢測試劑檢測不到感染者體內產生的抗體而出現假陰性的情況。
２、新冠病毒轉錄機理對檢測試劑性能的可能影響
在對核酸檢測假陰性的分析中也多次提到病毒載量對檢測結果的影響。實時PCR，就是檢測PCR擴增周期每個時間點上擴增產物的量，是通過對擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測，從而實現對起始模板（目的基因）的定量及定性分析。因此反應中病毒載量對應的目的基因含量將直接影響檢測結果，而檢測試劑的檢測限就是檢測試劑能檢測到的相應反應體系中的目的基因含量，如圣湘生物的新冠檢測試劑最低檢測限為200copies/ml，即可檢測出1ml反應中的最低病毒載量為200copies的病毒。在2020年4月23日《細胞》（Cell）雜志上發表的對新冠病毒的轉錄組體系結構的研究結果中發現，新冠病毒正鏈RNA進入宿主細胞后，一方面作為
mRNA指導轉錄蛋白合成，另一方面通過自身編碼的RNA 依賴的 RNA
聚合酶作用生成負鏈RNA，再以其為模板生成正鏈基因組RNA完成復制，正鏈基因組RNA由結構蛋白包裝后組裝子代完整病毒。新冠狀病毒的一個重要特點是其獨特的轉錄策略，新冠病毒基因組RNA還以負鏈RNA為模板進一步合成亞基因組RNA。新冠病毒轉錄體中含有大量亞基因組RNA[4]，ORF1ab基因由病毒全長基因組轉錄獲得，因此只存在于完整的病毒基因組，只能由病毒全長基因組轉錄獲得，而N基因同時存在于全長基因組和其他亞基因組RNA。那么，在新冠病毒轉錄過程中，其N基因轉錄合成量較ORF1ab更高。
對于此項新冠病毒的轉錄組結構研究，早期也有很多實際驗證支持，如韓國學者對于引物探針組的比較分析的一項研究中顯示：同樣的一個樣本，用中國、德國、香港、日本、泰國和美國官方推薦的引物探針進行測評，發現N基因檢測結果ct值較其他基因的小3個左右。中國的N基因+ORF1ab的組合，對新冠病毒檢測是更為敏感可靠的實驗室檢測方法[5]。
我國國家藥品監督管理局（NMPA）獲批的新冠PCR檢測試劑中，以雙靶標（ORF1ab與N基因）為主，如果單純檢測ORF1ab基因的試劑，對于無癥狀感染者或康復期類型的病毒載量較低患者，理論上患者體內病毒轉錄合成ORF1ab基因含量較N基因更低，其檢測漏檢風險更高，那么從《全國新型冠狀病毒核酸檢測室間質量評價結果報告》中對低濃度的病毒檢出情況也可以印證這個推論。對于低濃度樣本（128
copies/mL）能檢出的NMPA試劑廠家為圣湘生物及達安基因，均為ORF1ab與N雙靶標檢測試劑。
核酸檢測產品的即時研發和應用，在COVID-19患者的確診和臨床治療過程中發揮了重要作用，而選擇靈敏度高、特異性好、可重復性好的核酸擴增試劑是獲得準確檢測結果的基礎，因此對核酸檢測產品的性能及影響因素的關注是非常重要的[6]。
觀點小結：
1. 新冠病毒在傳播過程中發生了大量廣泛的變異，現階段尚未涉及影響到核酸檢測試劑的檢測性能，但發生在檢測目的基因ORF1ab區域及N基因的突變需持續關注；
2. S基因的突變可能導致蛋白構象及免疫原性發生改變，對于抗體檢測試劑帶來的影響不容忽視；
3. ORF1ab基因僅存在與于全基因組轉錄過程中，僅針對ORF1ab基因的單靶標核酸檢測試劑對低病毒載量樣本以及病毒突變株易造成漏檢，同時檢測N基因及ORF1ab基因的雙檢測靶標產品能更好的避免檢測試劑以上因素導致漏檢情況的發生。
