前沿峰(peak fronting)可能由多種情況引起。
一、樣品過載
當進樣量超過柱子的容量,樣品峰會呈現前伸或拖尾,解決方案就是減少進樣量。圖1顯示了進樣體積從1μl到10μl峰型的變化。這種問題一般在使用小體積色譜柱時表現更為明顯,所以色譜柱方法從常規250mm或150mm長色譜柱轉化到體積較小的快速分析柱時,由于柱子載樣量的變化,進樣量要按照柱體積相應減小而減小。
請看下面的案例:
色譜柱: ZORBAX SB-C18,3.0x 50 mm, 1.8 μm
流動相: 30 - 65% ACN 2.5分鐘;流速: 1 ml/min ;
溫度: 45 ℃; 檢測: 250 nm UV
樣品: 苯甲酸甲酯、苯甲酸丙酯、苯甲酸丁酯; 樣品溶劑: 甲醇
二、溶劑效應
在反相液相色譜中,如使用100%有機溶劑或100%強溶劑,大體積進樣時,將使色譜峰過早洗脫出色譜柱,導致峰變形。如需解決這個問題可以對分析物進行蒸發濃縮,從而減少進樣體積。或者進樣溶劑改為用水相/起始比例流動相稀釋,與流動相更為兼容,即使進樣體積較大也不會出現峰變形。較早流出的峰或靠近溶劑的峰更容易出現前沿。一般來說在液相色譜中用溶于流動相的小體積進樣最為理想。同理,在正相系統中,強極性溶劑溶解的樣品,大體積進樣時,越靠近溶劑峰的組分越容易引起前沿峰。
三、色譜柱渦流擴散
填料產生的空隙使流動相及溶質的流速比平均流速移動更快,從而導致峰拖尾或前伸。空隙產生的原因是填充不當,或填充柱床塌陷,如圖。
(a) 正常;(b)(c)柱塌陷
(a) 正常;(b)(c)柱塌陷
如果長期使用較高pH的流動相,或在色譜柱pH耐受范圍上限臨界點附近使用,是比較容易造成硅膠填料溶解塌陷的。這類問題很難修復,短時間內可以反方向運行,或者用同類型色譜填料填充塌陷柱頭,建議直接更換色譜柱。日常使用的過程中注意將溫度降低到40℃ 以下,特別是使用高pH流動相時;使用高溫兼容色譜柱,如雜化保護的硅膠柱、混合型柱、聚合物柱、氧化鋯柱等。如果需要使用特別高的pH條件,請使用特別適合在較高pH下操作的高覆蓋率或雙交聯固定相,或使用聚合物、混合型或氧化鋯反相柱。