現在有哪幾種PCR的方法

Qβ復制酶反應

Kacian等于1972年首次報報Qβ復制酶催化RNA模板的自我復制功能，它能在常溫30min，將其天然MDV擴增至109.1986年Chu等報道用生物標記的靶序列特異性探針，可與親和素聯接的MDV雜交，經洗脫未被結合的MDV后，再加入Qβ復制酶，擴增復制MDV拷貝，然后用溴乙錠染色檢測或用同源性的第二探針雜交.

Qβ復制酶是一種RNA指導的RNA聚合酶，它有3個特點:①不需寡核苷酸引物的引導就可啟動RNA的合成.②能特異地識別RNA基因中由于分子內堿基配對而形成的特有的RNA折疊結構.③在Qβ復制酶的天然模板MDV的非折疊結構區插入一短的核酸序列不影響該酶的復制.因而，如在此區插入核酸探針，則其序列照樣可能被Qβ復制酶擴增.

1988年Lizardi等，將靶基因序列插進MDV質粒里，用T7RNA聚合酶催化轉錄出MDV探針，這種RNA探針可與靶序列雜交，然后洗去非雜交的探針，加入Qβ復制酶來擴增探針，被擴增的探針又可作為模板進行擴增，并呈指數遞增.其產物按上述兩種方法進行檢測.現在該技術又發展了夾心雜交法，分子開關和靶依賴的復制等技術.
其擴增狀況，此法可用來檢測基因的突變，染色體重排或轉位，基因缺失及微生物的型別鑒定等.
反向PCR
反向PCR是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切酶對該段DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進行分析研究.
不對稱PCR
不對稱PCR是用不等量的一對引物，PCR擴增后產生大量的單鏈DNA這對引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為50～100∶1.在PCR反應的最初10～15個循環中，其擴增產物主要是雙鏈DNA，但當限制性引物低濃度引物消耗完后，非限制性引物高濃度引物引導的PCR就會產生大量的單鏈DNA.不對稱PCR的關鍵是控制限制性引物的絕對量，需多次摸索優化兩條引物的比例.還有一種方法是先用等濃度的引物PCR擴增，制備雙鍵DNA，然后以此dsDNA為模板，再以其中的一條引物進行第二次PCR，制備ssDNA.不對稱PCR制備的ssDNA，主要用于核酸序列測定.
重組PCR
使兩個不相鄰的DNA片段重組在一起的PCR稱為重組PCR，1986年報道了由PCR擴增的兩個DNA片段通過重組合后再經延伸而制備出新的DNA分子.其基本原理為將突變堿基，插入或缺失片段，或一種物質的幾個基因片段均設計在引物中，先分段對模板擴增，除去多余的引物后，將產物混合，再用一對引物對其進行PCR擴增.其產物將是一重組合的DNA.重組PCR主要用于位點專一堿基置換，DNA片段的插入或缺失DNA片段的連接(如基因工程抗體
多重PCR
一般PCR僅應用一對引物，通過PCR擴增產生一個核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定.多重PCR，又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同.
免疫PCR
免疫試驗的主要步驟有三個:①抗原抗體反應，②與嵌合連接分子結合，③PCR擴增嵌合連接分子中的DNA一般為質粒DNA該技術的關鍵環節是嵌合連接分子的制備.在免疫-PCR中，嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個結合位點，一個與抗原抗體復合物中的抗體結合，一個與質粒DNA結合，其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似，不同之處在于其中的標記物不是酶而是質粒DNA，在操作反應中形成抗原抗體-連接分子復合物，通過PCR擴增DNA來判斷是否存在特異性抗原.
免疫PCR優點為:①特異性較強，因為它建立在抗原抗體特異性反應的基礎上.②敏感度高，PCR具有驚人的擴增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于單個抗原的檢測.③操作簡便，PCR擴增質粒DNA比擴增靶基因容易得多，一般實驗室均能進行.
☆ PCR用于進化分析
進化遺傳學具有兩個并列的研究方向：系統發育的重建和種群分析。自1962年， Zuckerkandl和Pauling提出蛋白質序列和基因序列的比較可以象分子種一樣用于標志現存物種分化的時間以來，各種生化方法被用于系統發育的研究。在最初二十年內，同功酶的電泳分析、免疫學比較和蛋白質序列分析被廣泛地應用。而最近，DNA雜交和核糖體RNA序列分析為分類學做出了重要貢獻。這些技術大多有局限性，因為它們是估計而不是直接測量序列的差別。
☆ 反向聚合酶鏈反應
通常測定一個與已知序列相鄰的DNA序列是必要的，例如位于編碼DNA的上游和下游兩 側的區域，轉位因子的插入位點以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色體載體上 的DNA片段末段的未知序列的探針等。這種末端特異探針在Southern Blot或染色體要得到邊側序列的探針一般需要進行一系列費時、費力的工作，首先用內切酶裂解和 用已知邊側序列的探針Southern雜交以確定大小適合于克隆的末端片段;這些片段還 要經過凝膠分離、克隆，得到的物質再與已知邊側區域雜交以確定合適的克隆子。要 測定未吞邊側區序列時，通常需要從克隆中進行各種片段的亞克隆。
為避免這些步驟，我們采用擴展的PCR方法，使相鄰邊側區域得以擴增。典型的PCR擴增使用與互補鏈雜交的寡聚核苷酸引物。引物是定向的，使延伸向內跨過兩個引物之間的區域。一個引物的DNA合成產物作為另一個引物的模板，進行DNA變性、引物退 火，DNA聚合酶管伸反應的多次重復性循環，可使引物規定區域的拷貝數成指數增 加。但用傳統PCR方法得不到緊鄰引物外側的DNA序列，因為寡聚核苷酸所引導的既有 目的DNA又有引物外側區的DNA合成在拷貝過程中只呈線性增長，這種線性增長是因 為，對于每種引物來講，其不能引導DNA反向合成幾乎是同時，有三個實驗室分別設計出一種方法，使PCR可以擴增邊側區域。該方法反向PCR的基本點是用適當內切酶裂解核心區外分子，使這些酶切片段自身連接形成環狀分子，從而將邊側區域轉化為內部區域。
反向PCR程序
用傳統的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大小由 PCR擴增片段的大小決定，目前，PCR擴增的實際上限為3kb。在許多情況下，首先 需要進行Southern雜交來確定內切酶用以產生大小適于環化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心區的內切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板依賴于引物的上游或上游區，而不裂解核心區的酶則使兩上邊側序列都擴增，并帶有由內切酶和環化類 型決定的接點例如，互補突頭連接與鈍頭連接。對于擴增左翼或右翼序列，初試時 最好靠近識別上個堿基位位的酶，并已知在核心區有其方便的裂解位點。如果用反向 PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入 合適的酶切位點。
用T4連接酶在稀DNA濃度下環化更容易形成單環。在一些實驗中，為產生對反向PCR大小適當的DNA片段需要兩種內切酶，但這樣所產生的片段末端則不適于連接，環 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理鈍化。連接前，需用酚或熱變性使內切 酶失活。在我們實驗中，不必裂解環狀分子核心區也可得到有效的PCR擴增。這顯然不同于Silver和Keerikatter[7]的實驗結果，他們報道在核心裂解使模板線性化后，PCR擴增率增加100倍，但Triglia等則發現裂解環狀分子與加熱引起隨機缺口效果相同。
反向PCR的應用
反向PCR的應用已經證明該方法可以避免不方便的克隆和亞克隆步驟，因此可解決大 量問題。我們最初用反向PCR擴增E.coli天然分離物中轉位插入序 列ISL的邊側序列;Triglia等將反向PCR用于編碼瘧原蟲主裂殖子表面抗原前體的基因，在實驗中，他們用RsaⅠ酶裂解基因組DNA，連接，得到的環再用HinfⅠ在內部位點酶切，然后進行擴增，得到預期的297bp大小的片段，并用DNA直接測序進行鑒定。他們認為反向PCR由于具有從全長cDNA得到序列信息的優 點，將對步查現轉錄基因的5端或3端的邊側區域有用。
反向PCR的另一個應用是Silver和Keerikatte進行的。他們將其應用于擴增拉于整合在小鼠細胞中的外生原病毒DNA邊側的細胞DNA。除強調反向PCR在染色體“步查” 或“跳查”中的用途，他們還指出，該技術用于擴增特征性弱的序列，這 些序列在E.Coli或其他宿主載體系統中很騅或不能克隆。