核酸探針根據核酸的性質，可分為DNA和RNA探針;根據是否使用放射性標記物的與否,可分為放射性標記探針和非放射性標記探針;根據是否存在互補鏈,可分為單鏈和雙鏈探針;根據放射性標記物摻入情況,可分為均勻標記和末端標記探針。下面將介紹各種類型的探針及標記方法。 分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。
雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。
1. 切口平移法(nick translation) 當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應受幾種因素的影響: (a) 產物的比活性取決于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的質量會影響產物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應使用仔細純化后的DNA。
材料： 待標記的DNA。
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)10×切口平移緩沖液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。
(2)未標記的dNTP原液:除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3種分別溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,濃度為0.3mmol/L。
(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4單位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。
(5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。
(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。
(7)10mol/L NH4Ac。
操作步驟:
(1) 按下列配比混合:
未標記的dNTP 10μl
10×切口平移緩沖液 5μl
待標記的DNA 1μg
[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl
E.coli DNA聚合酶 4單位
DAN酶 I 1μl
加水至終體積 50μl
(2) 置于15℃水浴60分鐘。
(3) 加入5μl EDTA終止反應。
(4) 反應液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5mol/L, 加入兩倍體積預冷無水乙醇沉淀回收DNA探針。
[注意]
1、3H，32P及35S標記的dNTP都可使用于探針標記，但通常使用[α-32 P]-dNTP。
2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長度比較短。 隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探針。合成產物的大小、產量、比活性依賴于反應中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,產物平均長度為400-600個核苷酸。利用隨機引物進行反應的優點是：(1)Klenow片段沒有5'→3'外切酶活性,反應穩定,可以獲得大量的有效探針。(2)反應時對模板的要求不嚴格,用微量制備的質粒DNA模板也可進行反應。(3)反應產物的比活性較高,可達4×109 cpm/μg探針。(4)隨機引物反應還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。
材料：待標記的DNA片段。
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)隨機引物（隨機六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA）。
(2)10×隨機標記緩沖液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。
(3)Klenow片段。
(4)20mmol/L DTT。
(5)未標記的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。
(6)[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(7)緩沖液A：50mmol/L Tris·Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）; 0.5% SDS。
操作步驟:
(1) 200ng雙鏈DNA(1μl)和7.5ng隨機引物(1μl)混合后置于eppendorf管內,水浴煮沸5分鐘后，立即置于冰浴中1分鐘。
(2) 與此同時,盡快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管內混合下列化合物:
20mmol/L DTT 1μl
未標記的dNTP溶液 1μl
10×隨機標記緩沖液 1μl
[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl
ddH2O 1μl
(3) 將步驟(1)eppendorf管中的溶液移到步驟(2)管中。
(4) 加入5單位(約1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型離心機中以12000g離心1-2秒, 使所有溶液沉于試管底部,在室溫下保溫3-16小時。
(5) 在反應液中加入10μl緩沖液A后,將放射性標記的探針保存在-20℃下備用。同時計算放射比活性。
[注意]1、引物與模板的比例應仔細調整，當引物高于模板時，反應產物比較短，但產物的累積較多；反之，則可獲得較長片段的探針。
2、模板DNA應是線性的，如為超螺旋DNA，則標記效率不足50%。 用雙鏈探針雜交檢測另一個遠緣DNA時,探針序列與被檢測序列間有很多錯配。而兩條探針互補鏈之間的配對卻十分穩定,即形成自身的無效雜交,結果使檢測效率下降。采用單鏈探針則可解決這一問題。單鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:(1) 以M13載體衍生序列為模板,用Klenow片段合成單鏈探針; (2) 以RNA為模板, 用反轉錄酶合成單鏈cDNA探針。
1. 從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針 合成單鏈DNA探針可將模板序列克隆到噬粒或M13噬菌體載體中,以此為模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸為引物, 在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射標記探針，反應完畢后得到部分雙鏈分子。在克隆序列內或下游用限制性內切酶切割這些長短不一的產物,然后通過變性凝膠電泳(如變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)將探針與模板分離開。雙鏈RF型M13 DNA也可用于單鏈DNA的制備,選用適當的引物即可制備正鏈或負鏈單鏈探針。
材料：已制備好的單鏈DNA模板（方法參見第十章中有關內容）。
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)10×Klenow緩沖液：0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris·Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。
(2)0.1mol/L DTT溶液。
(3) [α-32 P] dATP：3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4)40mmol/L和20mmol/L的未標記的dNTP溶液。
(5)dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。
(6) Klenow片段（5單位/ml）。
(7)適宜的限制酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等。
(8)0.5mol/L EDTA （pH8.0）。
操作步驟：
(1)在0.5ml eppendorf管中混合如下溶液：
單鏈模板（約0.5pmol） 1mg
適當引物 5pmol
10×Klenow緩沖液 3ml
加水至 20ml
(2)將eppendorf管加熱到85℃ 5分鐘，在30分鐘內，使小離心管降到37℃；
(3)依次加入：
DTT 2ml
[a-32P]dATP 5ml
未標記的dATP 1ml
dGTP,dCTP,dTTP混合液 1ml
混合均勻后，稍離心使之沉于試管底部。
(4)加1ml（5單位）Klenow酶室溫下30分鐘。
(5)加1ml20mmol/L未標記的dATP溶液20分鐘。
(6)68℃加熱10分鐘，使Klenow片段失活。調整NaCl濃度，使之適宜于酶切。
(7)加入20單位限制性內切酶（如EcoRⅠ, HindⅢ等）酶切1小時。
(8)酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至終濃度10mmol/L。
(9)用電泳方法分離放射性標記的探針。
2. 從RNA合成單鏈cDNA探針 cDNA單鏈探針主要用來分離cDNA文庫中相應的基因。用RNA為模板合成cDNA探針所用的引物有兩種: (1)用寡聚dT為引物合成cDNA探針。本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA,并且產生的探針極大多數偏向于mRNA 3'末端序列。(2) 可用隨機引物合成cDNA探針。該法可避免上述缺點,產生比活性較高的探針。但由于模板RNA中通常含有多種不同的RNA分子,所得探針的序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針復雜得多, 應預先盡量富集mRNA中的目的序列。
反轉錄得到的產物RNA/DNA雜交雙鏈經堿變性后,RNA單鏈可被迅速地降解成小片段,經Sephadex G-50柱層析即可得到單鏈探針。 材料：已提純的RNA或mRNA
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)合適的引物：隨機引物或oligo(dT)15-18。
(2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。
(3) [a-32P]dCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。
(4)反轉錄酶(200000單位/ml)。
(5)100mmol/L DTT。
(6)250mmol/L MgCl2。
(7)1mol/L KCl。
(8)0.5mol/L EDTA (pH8.0)。
(9)10% SDS。
(10)RNasin(40單位/ml)。
操作步驟:
(1)在已置于冰浴中的滅菌離心管中加入下列試劑：
RNA或mRNA 10.0ml
合適的產物(1mg/ml) 10.0ml
1mol/L Tris·Cl(pH7.6) 2.5ml
1mol/L KCl 3.5ml
250mmol/L MgCl2 2.0ml
5mmol/L dNTP 10.0ml
[a-32P]dCTP 10.0ml
0.1mol/L DTT 2.0ml
Rnasin 20U
加水至 48ml
反轉錄酶(200000單位/ml) 2ml
混勻后,稍稍離心，37℃保溫2小時。
(2) 反應完畢后加入下列試劑： 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml
(3) 加入3ml 3mol/L NaOH。68℃保溫30分鐘以水解RNA。
(4) 冷卻至室溫后, 加入10ml 1mol/L Tris·Cl (pH7.4)。混勻。然后加入3ml 2mol/L HCl。
(5) 酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50柱層析或乙醇沉淀法分離標記的探針。 [注意] RNA極易降解，因而實驗中的所有試劑和器皿均應在DEPC處理后，滅菌備用。 現以Klenow片段標記3'末端為例說明末端標記的方法。
1、材料：待標記的雙鏈含凹缺3'末端的DNA。
2、設備：高速臺式離心機，水浴鍋等。
3、試劑：
(1)3種不含標記的dNTP各為200mmol/L。
(2)合適的限制酶。
(3)[α-32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。
(4)Klenow片段(5U/ml)。
(5)10×末端標記緩沖液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。
4、操作步驟：
(1)25μl反應體系中用合適的限制酶酶切1μg的DNA。
(2)按下列成分加入試劑并混勻： 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10×末端標記緩沖液 5ml 2mmol/L 3種dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 適量 加水至 50ml
(3)加入1單位的Klenow片段,室溫下反應30分鐘。
(4)加入1ml 2mmol/L 第四種核苷酸溶液, 室溫保溫15分鐘。
(5)70℃加熱5分鐘,終止反應。
(6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀來分離標記的DNA,或用Sephdadex G-50柱層析分離標記的DNA。
[注意]
1、利用本方法可對DNA分子量標準進行標記，利用它可定位因片段太小而無法在凝膠中觀察的DNA片段。
2、對DNA的純度不很嚴格，少量制備的質粒也可進行末端標記合成探針。
3、末端標記還有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶標記脫磷的5'端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用該酶進行交換反應標記5'末端。 利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。常用的寡核苷酸探針主要有兩種:單一已知序列的寡核苷酸探針和許多簡并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫。單一已知序列寡核苷酸探針能與它們的目的序列準確配對,可以準確地設計雜交條件,以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對序列雜交,對于一些未知序列的目的片段則無效。
1、材料：待標記的寡核苷酸(10pmol/μl)。
2、設備：高速離式離心機，恒溫水浴鍋等。
3、試劑：
(1)10×T4多核苷酸激酶緩沖液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6), 0.1mol/L MgCl2 , 50mmol/L DTT, 1mmol/L Spermidine·HCl, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(2)[γ-32 P] ATP(比活性7000Ci/mmol; 10mCi/ml)。
(3)T4多核苷酸激酶（10單位/ml）。
4、操作步驟：
(1)100ng寡核苷酸溶于30ml水中。置65℃變性5分鐘，迅速置冰溶中。
(2)立即加入下列試劑：
10×激酶緩沖液 5ml
[g-32P]ATP(比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10ml
T4多核苷酸激酶 2ml
加水至 50ml
混勻后置37℃水浴20分鐘。
(3)再加入20單位T4多核苷酸激酶，置37℃水浴20分鐘后立即置冰浴中。
(4)Sephadex G-50柱層析。
此方法是在每個探針的5'末端多加了一個磷酸，理論上，這會影響其與DNA的雜交。因此，建議使用Klenow DNA聚合酶的鏈延伸法獲得高放射性的寡核苷酸探針。
除了常見的同位素標記探針外，還有利用非同位素標記探針和雜交的方法，許多公司都有不同的非同位素標記探針的雜交系統出售，可根據這些公司所提供的操作步驟進行探針的標記和雜交。 許多載體如pBluescript, pGEM等均帶有來自噬菌體SP6或E.coli噬菌體T7或T3的啟動子,它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶所識別,合成特異性的RNA。在反應體系中若加入經標記的NTP，則可合成RNA探針。RNA探針一般都是單鏈,它具有單鏈DNA探針的優點,又具有許多DNA單鏈探針所沒有的優點，主要是： RNA:DNA雜交體比DNA:DNA雜交體有更高的穩定性,所以在雜交反應中RNA探針比相同比活性的DNA探針所產生信號要強。 RNA:RNA雜交體用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA雜交體容易控制,所以用RNA探針進行RNA結構分析比用DNA探針效果好。
噬菌體依賴DNA的RNA聚合酶所需的rNTP濃度比Klenow片段所需的dNTP濃度低,因而能在較低濃度放射性底物的存在下,合成高比活性的全長探針。 用來合成RNA的模板能轉錄許多次,所以RNA的產量比單鏈DNA高。并且用來合成RNA的模板能轉錄多次，可獲得比單鏈DNA更高產量的RNA。
反應完畢后，用無RNA酶的DNA酶Ⅰ處理,即可除去模板DNA,而單鏈DNA探針則需通過凝膠電泳純化才能與模板DNA分離。
另外噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶不識別克隆DNA序列中的細菌、質粒或真核生物的啟動子，對模板的要求也不高,故在異常位點起始RNA合成的比率很低。因此,當將線性質粒和相應的依賴DNA的RNA聚合酶及四種rNTP一起保溫時,所有RNA的合成,都由這些噬菌體啟動子起始。而在單鏈DNA探針合成中,若模板中混雜其他DNA片段,則會產生干擾。但它也存在著不可避免的缺點，因為合成的探針是RNA，它對RNase特別敏感，應而所用的器皿試劑等均應仔細地去除RNase；另外如果載體沒有很好地酶切則等量的超螺旋DNA會合成極長的RNA，它有可能帶上質粒的序列而降低特異性。
