光學顯微鏡的分類及調試

　　分類

　　光學顯微鏡有多種分類方法，按使用目鏡的數目可分為三目，雙目和單目顯微鏡；按圖像是否有立體感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡；按觀察對像可分為生物和金相顯微鏡等；按光學原理可分為偏光，相襯和微分干涉對比顯微鏡等；按光源類型可分為普通光、熒光、紅外光和激光顯微鏡等；按接收器類型可分為目視、攝影和電視顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目連續變倍體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、紫外熒光顯微鏡等。

　　雙目體視顯微鏡是利用雙通道光路，為左右兩眼提供一個具有立體感的圖像。它實質上是兩個單鏡筒顯微鏡并列放置，兩個鏡筒的光軸構成相當于人們用雙目觀察一個物體時所形成的視角，以此形成三維空間的立體視覺圖像。雙目體視顯微鏡在生物、醫學領域廣泛用于切片操作和顯微外科手術；在工業中用于微小零件和集成電路的觀測、裝配、檢查等工作。

　　金相顯微鏡是專門用于觀察金屬和礦物等不透明物體金相組織的顯微鏡。這些不透明物體無法在普通的透射光顯微鏡中觀察，故金相和普通顯微鏡的主要差別在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相顯微鏡中照明光束從物鏡方向射到被觀察物體表面，被物面反射后再返回物鏡成像。這種反射照明方式也廣泛用于集成電路硅片的檢測工作。紫外熒光顯微鏡是用紫外光激發熒光來進行觀察的顯微鏡。某些標本在可見光中覺察不到結構細節，但經過染色處理，以紫外光照射時可因熒光作用而發射可見光，形成可見的圖像。這類顯微鏡常用于生物學和醫學中。

　　電視顯微鏡和電荷耦合器顯微鏡是以電視攝像靶或電荷耦合器作為接收元件的顯微鏡。在顯微鏡的實像面處裝入電視攝像靶或電荷耦合器取代人眼作為接收器，通過這些光電器件把光學圖像轉換成電信號的圖像，然后對之進行尺寸檢測、顆粒計數等工作。這類顯微鏡的可以與計算機聯用，這便于實現檢測和信息處理的自動化，多應用于需要進行大量繁瑣檢測工作的場合。

　　掃描顯微鏡是成像光束能相對于物面作掃描運動的顯微鏡 。在掃描顯微鏡中依靠縮小視場來保證物鏡達到最高的分辨率，同時用光學或機械掃描的方法，使成像光束相對于物面在較大視場范圍內進行掃描，并用信息處理技術來獲得合成的大面積圖像信息。這類顯微鏡適用于需要高分辨率的大視場圖像的觀測。粗準焦螺旋：大范圍上下調動鏡筒。

　　細準焦螺旋：小范圍上下調動鏡筒。

　　調試

　　照明光路系統的調整

　　為了使顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明，在顯微鏡初次安裝和調試時，就必須把照明光路系統調整好，這是正確使用顯微鏡，并獲得正確、可*結果的重要手段和最基本的要求。此外，正確掌握照明光路系統的調整，是使用顯微鏡過程中更換光源燈泡后所必經的步驟，也是在日常使用過程中不時地檢驗顯微鏡性能的必要手段。顯微鏡照明光路系統的調整主要有以下4項內容：

　　1．照明光源燈室在顯微外的初步調整

　　① 首先將燈室的外殼打開，壓彈簧夾子將鹵素燈泡裝入插座中，安裝時避免手指直接接觸燈泡（可用柔軟的布或紙隔住），以免燈泡上留有指紋等臟物，影響燈泡的使用壽命。

　　②把燈室擺在桌面上，接通電源后，用專用的螺絲刀調節燈的調焦旋鈕孔（標有“←→”），使燈絲投影在1-2m外的墻上，將燈絲成像調至清晰；然后調節燈的高低位置調節絲孔（標有“──”），使燈絲位置高低適當；再調節燈的左右位置調節螺絲孔（標有“──”），使燈絲左右位置合適。

　　2．光源發光體（燈絲）在顯微鏡內位置的檢驗和校正

　　目的是為了把發光體的像端端正正地調入物鏡的視域范圍內，從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明，這是調整庫勒照明系統的前提條件。需要的基本工具：對中望遠鏡購置顯微鏡時已配備。

　　① 拔掉燈庫內的毛玻璃套筒，把燈室裝回顯微鏡上

　　②選用10×物鏡，開亮光源程序找樣品并調焦清晰，再換用40×物鏡把樣品調焦清晰（40×物鏡可以看清燈絲的全貌）；

　　③把聚光鏡的孔徑光闌和視場光闌均開到最大；

　　④拔掉其中一個目鏡，換上對中望遠鏡，抓住白色部分，另一手伸縮黑色接目鏡，就可在視野中看到燈絲像；

　　⑤如燈絲位置不合適，調“──”孔，把燈絲像沿水平方向調好，調“──”孔，把絲像沿垂直方向調好，直至將燈絲像調至剛好充滿物鏡孔徑的光圓像；

　　⑥調整完畢后，將毛玻璃套筒插回原位，拔掉對中望遠鏡，換回目鏡作下一步調整。以上所述照明光源燈室在顯微鏡外的調整和光源發光體在顯微鏡內位置的校驗，只需在顯微鏡初次安裝調試及更換燈泡時進行，平時使用顯微鏡時不能隨意亂調亂動。萬一調亂時，可按上述步驟調回原狀。

　　3．庫勒照明（Kohler）系統的正確調整

　　顯微鏡的正確調試，主要工作之一是照明光路系統的調整，而其中的關鍵是庫勒照明系統的調整。對于每一位使用顯微鏡的人員，特別是作顯微照像的人員來說，應該對庫勒照明系統的原理及其調整步驟有一定的了解和掌握，才能充分發揮顯微鏡應有的功能，拍出來的照片才能在效果上比較一致而又完善。庫勒照明系統的原理簡單來說就是：光源發光體上任意一點發出的光，可以照明顯微鏡的視域范圍，而光源發光體上每一點所發出的光匯集起來，在顯微鏡的視域中就實現了非常充分而又均勻的照明。調整庫勒照明系統的目的，是為了使所觀察的視域能獲得均勻而又充分的照明，防止雜散光對照像系統造成影響或干擾，以免照像時在底片形成灰霧。高調整庫勒照明系統的必要部件：視場光闌、可進行合軸調整的聚光鏡系統。

　　① 選用10×物鏡和10×目鏡

　　② 把聚光鏡前端透鏡擺進光路中，孔徑光闌調至適中的位置上（不大不小），再把聚光鏡升到最頂的位置上，聚光鏡轉盤調至明視野“J”位置

　　③ 把視場光闌調至最小（0.1）

　　④ 載物臺上放上已封片的生物樣品，開亮光源，調焦清晰

　　⑤ 視域中會出現一個局部照明的區域或亮斑，這是視場光闌的模糊像，在其中可以清晰地看到樣品的細節；在它之外是較暗的視域，不一定能把樣品的細節看得清楚

　　⑥把聚光鏡微微地向下調，使視野中的亮斑逐漸收小，慢慢變成一個清晰的多邊形象，這便是視場光闌的清晰像；

　　⑦一般情況下，多邊形象并不在視域中央，需要調整聚光鏡的一對調中螺絲，把視場光闌多邊形的像調至中央位置；

　　⑧逐漸開大視場光闌，使多邊形象成為視域的內接多邊形，進一步核對調中的狀況，如對中不夠理想，繼續微微調對中螺絲；

　　⑨將視場光闌稍為再微微開大一些，使它的多邊形象恰好消失在視域的邊緣上，至此，庫勒照明系統調整完畢。庫勒照明系統調整好以后，整個視域照明均勻，拍攝的顯微照片明亮清晰，反差正常。在日后使用過程中應特別注意： a. 視場光闌不可任意開大，但可隨物鏡倍數的增大而將視場光闌收小，隨物鏡倍數的減小而開大； b. 聚光鏡的高低位置不準亂調，否則會破壞已調整好的庫勒照明系統； c. 使用10×以下物鏡時要將聚光鏡前端透鏡擺出光路外，使用10×或10×以上物鏡時要將前端透鏡擺入光路中； d. 關于物鏡倍數與視場光闌大小配合問題，在實際使用過程中，作為一般觀察不一定要收小或開大視場光闌，但作顯微照相時，為了避免雜散光線對照相系統的干擾，以便能拍攝到較完善的照片，則應在使用每一個倍數的物鏡時，把視場光闌調節到正好消失于所觀察的視域邊上，這是比較繁復的工作，但又非做不可。較為簡便的方法是把與各個倍數物鏡相對應的視場光闌事先調整好，并作好記號，以后使用時根據記號直接調至相應的位置。

　　4．孔徑光闌的正確使用

　　由于聚光鏡的孔徑光闌可以影響顯微鏡的分辨率，使用時應掌握正確的使用方法。過去由于對孔徑光闌的認識不足，往往把它當作是調節視野亮度的工具。雖然調節孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度，但會直接影響成像的反差、對比度及分辨率，在使用過程中應盡可能避免。為了發揮聚光鏡孔徑光闌的作用，以便在觀察時，尤其在作顯微照相時獲得最佳分辨率，在每換用一個倍數的物鏡時，在樣品調焦清晰后，需要調節孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數值孔徑（物鏡孔徑像）的2/3 。調整方法是用對中望遠鏡對焦于視野中黑色相差環上，調節孔徑光闌，可以看到一個多邊形的孔徑光闌像，然后調到等于物鏡孔徑像的2/3，即介于黑色相差環外與圓形視域內之間。為方便起見，可把與各倍數物鏡相對應的孔徑光闌預先調整好，并作好標記，以免每次使用都要重新調整。

　　成像光路系統的調整及顯微鏡檢術概要

　　顯微鏡成像光路系統的調整，是根據不同顯微鏡檢術的需要而進行的。所謂顯微鏡檢術（microscopy），概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術與方法。以下簡述顯微鏡檢術中已成熟的幾種方法及對應的顯微鏡成像光路系統的調整方法。

　　1．透射光明視野：

　　這是自顯微鏡發明以來最傳統、最普遍的應用方法。基本部件： a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察； b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，最好配有孔徑光闌。調整方法：在上述顯微鏡的庫勒照明系統調整好后，即可應用明視野法。適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等。注意事項： a. 使用明視野方法觀察時，一定要將庫勒照明系統調整好； b. 視場光闌不可任意開大，使用10×、10×以下和10×以上物鏡時，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實出和擺進光路中； c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調節視野的亮度，更不要亂調聚光鏡的高低位置，否則，會降低顯微鏡的分辨率和破壞已調整好的庫勒照明系統； d. 作顯微照相時，每換用一個倍數的物鏡，就要調節聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數值孔徑的2/3 。

　　2．透射光相差法：

　　這是現代顯微鏡檢術中的一種反差增強法。基本部件：相差物鏡、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡、對中望遠鏡、綠色濾光片。

　　調整方法：

　　a. 在庫勒照明系統調整好的基礎上，用明視野方法把樣品調焦清晰

　　b. 把聚光鏡轉到Ph1對準轉盤刻度線位置，選用10×相差物鏡，換上待觀察的透明樣品

　　c. 拔掉其中一個目鏡，換上對中望遠鏡，并調焦于視野中的兩個相差環上（物鏡的黑色相差環和聚光鏡的透光相差環）

　　d. 視野中的兩個相差環不一定重合，調節聚光鏡上的兩個調節裝置（調整相差環左右位置的調節桿和調整前后位置的摩擦式轉鈕），使透光環作前后左右移動而與黑環重合

　　e. 調整好后，換回觀察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中，即可觀察到樣品的相差像

　　f. 有20×和40×物鏡觀察時，聚光鏡應設在Ph2位置上，用100物鏡時，聚光鏡應設在Ph3位置上。

　　適用范圍：適用于觀察透明、未染色或不能染色的樣品，如各種細胞、活組織、未染色或不染色的組織切片、水生生物等。

　　3．微分干涉相襯法：

　　為了克服相差法觀察時樣品細節像周圍伴隨有光暈，會掩沒掉本來應該看見的細節，以及樣品或組織切片厚度要求相當薄，原則上下能厚于10?m等局限性，利用雙光束干涉的原理設計子微分干涉相襯法。

　　調整方法：

　　a. 必須在庫勒明系統已調好的基礎上才能調好DIC方法

　　b. 先用10×物鏡，以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調焦位置

　　c. 把起偏器（polarizer）擺入照明光路中，注意其取向應為東—西方向

　　d. 把聚光鏡轉盤轉到與10×物鏡對應使用的位置上，即DIC 0.3—0.4

　　e. 在物鏡后方或物鏡轉換器上插入10×物鏡使用的DIC插片（DIC slider）

　　f. 把檢偏器（analyser）插入成像光路中，注意其取向應為南—北方

　　g. 換上待觀察的透明樣品，開亮光源把樣品調焦清晰

　　h. 調節DIC插片，使微分干涉相襯的像達到最佳效果，也就是浮雕效果最為明顯

　　i. 同時可調節聚光鏡的孔徑光闌，使反差的效果也達到最佳

　　j. 然后再細微調樣品的細節，可見樣品中不同層面上的結構

　　k. 如果把補色器（first order red retardation plate）插入，并同時調節DIC插片，可在視野中看到不斷變化的絢麗色彩，紅、橙、黃、綠、藍、紫、粉紅、粉紫及金黃色都具有。適用范圍：透明或不能染色的組織切片，厚度可達100?m左右，培養中的活組織和活細胞、小生生物等。

　　4．落射光激發的熒光法（incident-loght fluorescence Epi-FL）：

　　簡稱為落射熒光法，是近代顯微鏡檢術中新發展出來的一種強有力的反差增強法。它將激發熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經反光鏡射入物鏡去激發樣品，從樣品上被激發的熒光經物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡便，效率高，50W的光源強度比透射熒光法的250W還強。熒光方法是利用波長較短的紫外光、紫光、藍紫光、藍光及綠光等去激發樣品，只要樣品中含有可產生熒光的成分，它便吸收短波的激發光而釋放出波長較長的熒光。不同物質只能吸改特定波長的激發光，而釋放的熒光也會有特定的波長，因而用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細菌和螺旋體，受紫外光激發后能發出它們特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質吸收激發光后放出特有熒光的方法稱為自發熒光法。某些物質自身不會吸收激發光，或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質，這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應用于醫學、生物學及工業的特異性研究和鑒別上。調整方法：熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡，調整的方法大致相同。

　　① 汞燈的安裝：

　　a. 打開包裝，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上，安裝時注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面，汞燈的封氣口要對向散熱帽的左側或右側

　　b. 把汞燈的上電極引張安裝并固定在散熱帽底面的小孔上，再把汞燈的下電極及上電極引線另一端，分別安裝在燈座上各自的插孔中并固定

　　c. 鎖緊散熱片上的螺絲后，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中，鎖緊相應的螺絲，再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源后部專用的插座上。

　　d. 詳細的安裝方法請參照有關說明書。

　　② 汞燈燈室在顯微鏡外的初步調整：

　　a. 接通汞燈電源，讓汞燈預熱10-15min

　　b. 把汞燈燈室擺放在桌面上，讓汞弧投影到2-3m外的墻上，劃一條與燈室窗口中心線對地高度一樣的水平線作為參考線

　　c. 轉動燈室調焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影于墻上

　　d. 分別調節燈室外殼上的5個調節螺絲孔，把汞弧的像其反射像調成并排且盡量*近，但不要重疊在一起。

　　③汞燈汞弧在顯微鏡內位置的檢驗：

　　a. 將汞燈照明光路系統中的視場光闌開到最大

　　b. 把熒光濾光片組推到藍光激發的位置上，以避免汞燈中的藍光太刺眼

　　c. 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物臺上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙

　　d. 取下一個物鏡，使激發的藍光經物鏡轉換器的空檔照在白紙上，白紙上會有一藍色的圓形照明區域，汞弧的像及其反射像都應該出現在這區域的中央部位，否則，可調節燈室調焦旋鈕至最清晰，然后分別調節燈室外殼上的5個調節螺絲孔，直至汞弧的像及其反射像并排在照明區域的中央位置。

　　e. 調好之后，把物鏡裝回去，通過目鏡可見白紙被藍光激發后發射出的黃綠色熒光

　　f. 仔細調焦，可看清白紙的纖維；取去白紙，樣品上的熒光細節隱約可見而很容易調焦清晰。

　　④汞燈使用注意事項

　　通常使用的為50W超高氣壓汞燈，燈管內通有一對鎢電極和液態汞（室溫下附在管壁上），未點燃時，管內氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓角發點燃后，汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產生強光，溫度升高，管內氣壓迅速升到10個大氣壓。由于是高氣壓的氣體放電，必須了解其特性才能安全地使用汞燈。

　　a. 汞燈接通電源后需要10-15min預熱時間，汞才能充分汽化并形成汞弧，產生高亮度而穩定的激發光。因此，觀察前要提早通電

　　b. 汞燈在使用過程中，不要隨意開關汞燈的電源

　　c. 關掉汞燈電源后，必須等待15-20min，待汞燈自燃冷卻后才可再次接通電源，違反這一操作規定時，將會造成嚴重后果！由于汞燈內的汞蒸氣未完全液化，汞蒸氣內阻很小，一旦通電在兩電極間施加電壓，汞燈內形成強大的電流，輕則燒斷保險絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈，重則汞燈爆炸，汞蒸氣彌漫整個實驗室，造成工作人員中毒，不僅損失了汞燈，還會炸毀燈室內的集光-聚光部件。

　　d. 汞燈的使用壽命一般只有300h，使用得當可達600h，使用壽命與開關的次數成反比，應集中一批樣呂作2-3h的觀察。汞燈價格及昂貴，應珍惜使用。

　　e. 汞燈壽命終結的標志是點燃困難，燈管發黑。

　　5．暗視野法（dark field）：

　　許多透明或半透明的樣品，如細菌、微生物、細胞內的精細結構及結晶體的內含物等，在明視野顯微鏡中不容易看清楚，如果采用暗視野法就可以大大提高樣品的可視度。以暗視野法所看到的是襯托在黑暗視野背景中發亮的樣品輪廓及其細節。普遍光學顯微鏡的最高分辨率為0.2μm，而暗視野顯微鏡雖然對樣品的細節構造分辨不清楚，但卻可看到0.004μm以上微細顆粒的存在，即可以看到亞顯微結構，特別適合用來觀察微細的顆粒與細菌等。調整方法：暗視野法的主要必需部件是暗視野聚光鏡。使用時須先用明視野聚光鏡把庫勒照明系統調整好。換上暗視野聚光鏡時，要把載玻片（樣品）移開，將浸沒油滴在聚光鏡頂部，再把樣品載玻片擱在物臺上，浸沒油便充填在兩者之間，這種聚光鏡須與裝有可變光闌的100×油鏡配用。另一種中倍率干式暗視野聚光鏡可與中倍率的物鏡配用，這種聚光鏡具有中央光擋，照明光只能透過光檔與聚光鏡邊緣之間的透光環才能進入聚光鏡內。對于配備齊全的相差顯微鏡，與編號為Ph3物鏡配用的相差聚光鏡相差環，可以和10×及10×以下的相差物鏡配用而形成低倍率的暗視野效果。