四款主流的激光捕獲顯微切割平臺（下）

　　目前市場上主要有四家公司提供激光顯微切割的平臺，他們分別是Arcturus/Life Technologies、徠卡、蔡司和MMI。在上一篇文章中，我們介紹了前兩個，這回則帶您看看MMI和蔡司的產品，以及新手該如何選擇。

　　MMI

　　瑞士MMI公司的單細胞獲取平臺有兩大旗艦產品：CellEctor Plus單細胞分選系統和CellCut Plus激光顯微切割系統。

　　? CellEctor Plus可從血液、骨髓、制備的組織細胞懸浮等液態體系中挑選出感興趣的單細胞;

　　? CellCut Plus可從組織切片、貼壁培養細胞中將感興趣的單細胞切割并收集下來。

　　CellCut Plus利用固態紫外激光對組織切片等樣本中感興趣的細胞進行切割和收集，“三明治”式的樣本制備方式避免環境尤其是RNase污染。在整個分離過程中，激光都不與需要分離的樣本接觸，對樣本損傷小，從而保證了樣本RNA的完整性。

　　此系統在樣本收集時采用PTP(Predefined Target Positioning)技術，將黏性管蓋劃分成若干區域，對組織切片中同種類型細胞進行黏附收集，提高樣品的收集效率，節省成本;通過計量統計可保證下游的核酸、蛋白實驗有足夠的樣本量。

　　CellEctor Plus和CellCut Plus均是基于顯微鏡的產品，兩大系統可完全整合在一起形成MMI單細胞獲取自動化工作站，以“所見即所得”的方式，幾乎涵蓋所有的單細胞獲取途徑。

　　蔡司

　　蔡司的PALM MicroBeam也是利用聚焦激光束來切割和分離樣本，不過它收集樣本的方式比較特別。通過一種激光誘導的壓力波將細胞彈入管中。MicroBeam的彈射力就好像在您的樣品下方發生光誘導的微型爆炸，隨之而來的沖擊波向上推動組織。對于較大的區域，MicroBeam也可以使用粘性管蓋。這對蛋白質組研究特別有用，因為您可能需要較大的樣品來獲得足夠的信號。

　　專家的選擇和建議

　　你們若打算采購一臺LCM儀器，一定會被繁復的儀器參數和眾多專業術語繞暈。撇開這些不談，我們先看看專家會選擇何種儀器，開展哪些應用。

　　LCM技術的發明人Lance Liotta如今是喬治梅森大學(George Mason University)應用蛋白質組學和分子醫學中心的聯合主管。他們實驗室擁有三臺LCM系統，都是來自Arcturus：第一代手動的PixCell 儀器;具有圖形用戶界面的Veritas系統;以及最新的雙激光ArcturusXT?。

　　據Liotta介紹，實驗室主要在臨床試驗工作中使用這些儀器。舉個例子，該中心臨床蛋白質組實驗室的主管Virginia Espina在抗癌藥物治療前后，對100名乳腺癌患者的腫瘤組織進行顯微切割。之后從那些樣品中提取蛋白，上樣到蛋白芯片上，以確定藥物對近60個蛋白標志物的量和磷酸化的影響。此信息有望指導治療決策。

　　Espina建議用戶在準備開展激光捕獲工作之前，考慮四個關鍵問題。第一，組織如何固定?是福爾馬林包被石蠟包埋(FFPE)還是冷凍?它是新鮮的還是存檔的?第二，你希望用它做什么?DNA相對容易收集，而RNA迅速降解。第三，你需要多少細胞?核酸可以擴增，因此可研究相對少量的細胞甚至單細胞。蛋白則需要更多材料。通常來說，大約在10000至50000個細胞。第四，你將使用哪種提取方法，它是否與下游實驗兼容?

　　在美國SAIC-Frederick公司的組織技術實驗室，研究助理Yelena Golubeva使用兩種系統開展LCM工作：一臺Arcturus的PixCell IIe和一臺MMI的CellCut Plus。前者是用于切割相對小的區域，從單細胞到直徑在25微米左右的區域。對于大的區域，她使用MMI，因為激光切割更快。

　　Golubeva認為，就LCM而言，每個樣品都是獨特的。例如，小鼠肝臟樣品的RNA相對穩定，而前列腺樣品幾乎馬上開始降解。這是個經驗問題。

　　Golubeva建議用戶開展一些預實驗。從一些感興趣組織的切片開始。檢驗一下你希望使用的染料，看看它是否會損害你想要研究的生物分子。染色一塊切片，從上面刮下一些細胞，提取出RNA，并與未染色切片的結果進行比較，了解整體質量和qPCR數據。如果OK，那么可以使用這種染料。

　　接下來，優化時間。在RNA質量下降之前，你能夠在切割上花多少時間?十分鐘?二十分鐘?Golubeva認為，使用什么樣的儀器都不要緊，你需要知道組織在LCM儀器以及你使用的耗材中表現如何。

　　專家也建議我們了解其他一些變量，比如切割的速度和力量，就像我們之前提到的徠卡LMD7000和LMD6500。7000的功率和頻率可調，也能切割更硬的切片，比如骨頭、牙齒以及植物纖維組織。

　　一般來說，冷凍切片最好在當天進行顯微切割，切好的冷凍切片可暫時存放在-70℃低溫冰箱備用。冷凍切片厚度約為10 μm，較厚的切片容易捕獲到較多的細胞，但有可能導致非特異性地捕獲鄰近的細胞，較薄的切片捕獲細胞量相對較少，但捕獲的細胞比較純凈。

　　關于LCM，目前已經有3000多篇文獻發表，新應用和新方法也在不斷涌現。但如果你是新手，那么不妨讀一讀Lance Liotta實驗室2006年發表在《Nature Protocols》上的操作方案1。