正相液相色譜方法建立的一般模式與反相液相色譜類似。正相液相色譜的色譜柱選擇范圍較寬，氰基柱通常是首選；與氰基柱相比，硅膠柱可獲得更大的值，適合于異構體和疏水性溶質的分離，但分析時必須嚴格控制流動相中水含量，也不適于梯度分離:二醇基柱和氨基柱穩定性較差，僅在其他類型正相色譜柱無法完成分離時采用；氧化鋁柱具有獨特的分離選擇性，但有柱效低、保留值不定、回收率低等缺點，很少使用。
一般來說，柱尺寸為0.46cm×25μm×5μm，初始流速設為2ml/min，柱溫為35℃或室溫，初始進樣量較大，但不應超過50μl或50μg。
正相液相色譜流動相首選是正己烷和丙醇組成的混合溶劑，正已烷-丙醇不僅在低紫外波長區吸收較弱，還可提供較寬的溶劑強度范圍，適于分離極性差異較大的樣品。除正己烷外，溶解性較好的1,1,2—三氟三氯乙烷（FC113）也可作為混合溶劑中的A溶劑，由于在低波長吸收較強，只能用于235m以上的檢測，并且其對臭氧的破壞作用也限制了其使用。除丙醇外，B溶劑還可采用二氯甲烷、甲基叔丁醚、乙酸乙酯、乙腈等，其中丙醇適于低波長檢測（<215m）條件下強極性樣品的分離:二氯甲烷是高波長（>235nm）檢測條件下的B溶劑首選，但洗脫強度較低:甲基叔丁醚和乙酸乙酯可在225nm以上波長使用，其加入可改變α值:乙腈也可改變樣品的α值，并在195mm以上波長范圍均無明顯紫外吸收，但是與正己烷的混溶性較差，需要另外加入共溶劑才可使用。
與反相液相色譜方法優化過程相似，可采用0~100％丙醇-正己烷初始梯度在氰基柱上進行初始條件分離，根據結果調整梯度程序或估算等度分離條件。為了調節分離選擇性，可調節B％或采用兩種B溶劑，但流動相中通常不應超過三種溶劑。當僅改變流動相組成效果不明顯時，可改變柱類型以獲得更好的分離效果。
在正相液相色譜柱上，流動相中的極性溶劑與固定相相互作用較強，調整流動相比例時需要更長的平衡時間（至少20倍柱體積）。
水是強極性溶劑，與硅膠或氧化鋁鍵合相當牢固，流動相中含有的微量水分會被固定相從流動相中萃取出來，導致保留時間下降。流動相中水分受到空氣濕度影響，難以保證流動相的含水量固定不變，因此，采用硅膠柱時，通常會用一定量的水平衡流動相，保證含水量穩定。
