酶結合物是酶與抗原或者抗體、半抗原在交聯劑作用下聯結的產物,是 ELISA 成敗的關鍵試劑。它不僅具有抗原抗體的特異性反應,還具有酶促反應的特性,最終產生生物放大的特性。酶免疫反應中,最常用的酶是辣根過氧化物酶,HRP的催化反應需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料,通過反應可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應的過程如下:
供氫體的種類很多,形成的產物特點不一。如 DAB(3,3-二氨基聯苯胺)的反應產物為不溶性沉淀物,并有電子密度,故適宜做免疫酶染色或電鏡觀察。5-氨基水楊酸(5-AS)早期曾用于 ELISA,但其溶解度不夠大,且空白孔不易控制到無色,現已很少應用。鄰聯甲苯胺(OT)的特點是能產生鮮艷的藍綠色產物且靈敏度較高,但反應中受溫度的影響較大,而且由于產物不穩定,需要在短時間內進行測定。HRP 最常用的色原底物(供氫體)有鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯苯胺(TMB)以及4-氨基安替比林等,其中 OPD 形成的產物為深橘黃色或棕色,但是因為具有致癌性,且顯色不穩定,因此近年來人們更愿意用性質更穩定又無致癌作用的TMB。TMB 產物為藍綠色,可溶性較好,在避光處顏色穩定,空白可近于無色,靈敏度比 OPD 可高4倍以上。另外,還有一種供氫體稱2,2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)(ABTS),其反應產物呈藍綠色,且靈敏度和穩定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面,ABTS 與 TMB 皆是值得被優選的供氫體。
由于 HRP 的底物 H2O2 本身又是酶的抑制劑,因此酶促反應中使用的 H2O2 不能過量,應控制在經較短時間反應后呈色即達高峰(說明 H2O2 已消耗殆盡)。這樣即使再延長時間也不會增加反應產物的顏色。