免疫熒光技術在實際應用上主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣品上直接滴加已知特異性熒光標記的抗血清,經洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結果。免疫熒光直接法可清楚地觀察抗原并用于定位標記觀察。間接法是在檢測樣品上滴加已知的細菌特異性抗體,待作用后經洗滌,再加入熒光標記的第二抗體。如研制成的抗沙門氏菌熒光抗體,用于750例食品樣品的檢測,結果表明與常規培養法的符合率基本一致。
在食品衛生檢疫中,熒光標記抗體檢測標本的制作應力求保持抗原的完整性,并在洗滌和固定過程中不發生溶解或變性。此外,為了便于抗原和抗體接觸形成抗原-抗體復合物,以及有利于觀察和記錄,要求制作的標本盡量薄,對標本中干擾抗原-抗體反應的物質應充分洗滌除去,以免影響標本的觀察以及結果的判定。
熒光標記抗體檢測標本的制作方法為:
①涂片:先將載玻片通過火焰3次,冷卻后,挑取被檢材料涂布成直徑約1cm的圓形涂片,如材料太濃,也可將生理鹽水加入被檢材料中,混勻后均勻涂片。涂好后,晾干或以電風扇吹干備用;
②固定:不同的抗原采用不同的固定劑,一般常用的固定劑為95%～100%乙醇和丙酮,固定的條件溫度為37℃、時間為3～15min,某些病毒最好以丙酮在-40～20℃下,固定30min,固定后應隨即用PBS反復沖洗,干后即可用于染色。固定的目的是防止標本從玻片上脫落,以及去除組織中妨礙抗原抗體結合的類脂質。