色譜鑒別法
色譜鑒別法是指利用不同物質在不同的色譜條件下,比移值(Rf)或保留時間(tR)等是否一致來判定樣品是否符合標準。因此,色譜法可用于多組分中的藥物鑒別。
1.薄層色譜鑒別法
薄層色譜法鑒別原理為同一種藥物在同樣條件下的薄層色行為相同。一般采用對照品(或標準品)比較法,將供試品和對照品(或標準品)按藥典規定,用同種溶劑配成同樣濃度的溶液。在同一層板上點樣、展開、顯色,要求供試品斑點應與對照品(或標準品)斑點的位置(Rf)和顏色一致。薄層色譜法簡單易行,適用于鑒別藥物及其制劑的真偽;其應用范圍日益擴大,特別是高效薄層色譜應用于中藥鑒別方面。
在薄層色譜鑒別時需注意,點樣基線距底邊10～15mm,高效板一般基線離底邊8～10mm。點樣時小心,不要損傷薄層表面;點樣的直徑一般不大于3mm,高效板一般不大于2mm;點間距離可視斑點擴散情況調整,并保證相鄰斑點互不干擾,一般不少于8mm,高效板供試品間隔不少于5mm。展開前如果需要溶劑蒸氣預平衡,可在展開缸中加入適量的展開劑,密閉保持15～30min。溶劑蒸氣預平衡后,迅速將點好供試品的薄層板放入展開缸中,進入展開劑的深度為距原點5mm為宜,展開劑不得沒過原點,密閉,靜置。除另有規定外,一般上行展開8～15cm,高效薄層板上行展開5～8cm。溶劑前沿達到規定的展距,取出薄層板,晾干,待檢測。
供試品顯色的方法:①含有可見光下有顏色的成分可直接在日光下檢視,也可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色,或加熱顯色,在日光下檢視。②有熒光的物質或遇某些試劑可激發熒光的物質可在365nm紫外光燈下觀察熒光色譜。③對于可見光下無色、但在紫外光下有吸收的成分可川熒光薄層板(如硅膠GF254板)檢測,硅膠GF254板是在硅膠中摻入了少量熒光物質面制成的板,在254nm紫外燈下,整個薄層板呈黃綠色熒光,被測物質由于熒光猝火作用而呈現暗斑。
如葡萄糖酸鈣鑒別項下要求“取本品50mg,加水5mL,溫水浴溶解,濾過,取濾液作為供試品溶液。另取葡萄糖酸鈣對照品,同法制成每1mL中含10mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗,吸取上述兩種溶液各5μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙醇-水-濃氨溶液-乙酸乙酯(50:30:10:10)為展開劑,展開,晾干,置110℃加熱20min后,放冷,噴以鉬酸銨-硫酸鈰試液(取鉬酸銨2.5g,加1mol/L硫酸溶液50mL使溶解,再加硫酸鈰1.0g,加1mol/L硫酸溶解并稀釋至100mL,搖勻),再在110℃加熱10min后,取出放冷,10min后檢視。供試品溶液所顯主斑點的位置和顏色應與對照品溶液的主斑點相同”。
2.高效液相色譜和氣相色譜鑒別法
一般規定按供試品含量測定項下的高效液相色譜條件進行試驗,要求供試品和對照品色譜峰的保留時間(tR)一致。含量測定方法為內標法時,要求供試品溶液和對照品溶液色譜圖中藥物峰的保留時間與內標物的保留試劑比值應相同。高效液相色譜和氣相色譜鑒別法操作比較復雜,耗時長,一般在檢查或含量測定項下已采用色譜法的情況下,才采用這兩種方法做鑒別。
如紫杉醇鑒別項下要求“在含量測定項下的色譜圖中,供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致”。含量測定項下規定“取本品約12mg,精密稱定,置100mL量瓶中,加乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取10μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖;另取紫杉醇對照品,同法測定。按外標法以峰面積計算,即得”。