作為免疫分析法的一種，FIA同樣存在兩種模式，即競爭型和夾心型。其中競爭型（以標記抗原的競爭型為例）的測定原理是基于未標記的抗原（Ag）和標記抗原（Ag-L）競爭結合有限的抗體（Ab）而實現的免疫分析法。檢測時，Ab和Ag-L的濃度是固定的。當未標記的Ag加到Ab和Ag-L的免疫混合物中后，Ag和Ab的結合使得Ag-L與Ab的免疫復合物的量減少。樣品中存在的Ag越多，Ab結合的Ag-L便越少，從Ab-Ag-L免疫復合物的減少或游離Ag-L的增加，可以定量測定出樣品中待測抗原的含量。其反應過程如下：Ag+Ag-L+Ab≒（Ag：Ab）+（Ag-L：Ab）
對夾心型免疫分析來說，其反應原理是在免疫反應的載體上固定過量的Ab，然后加入一定量的Ag，免疫反應后，再加入過量的標記抗體（Ab-L），以形成“三明治”式夾心免疫復合物。樣品中存在的Ag越多，結合的Ab-L也越多，夾心免疫復合物的標記熒光信號就越強。反應過程如下：Ab+Ag≒Ab：Ag≒Ab：Ag：Ab-L。