一、性狀
頭孢氨芐、頭孢克洛及頭孢呋辛鈉的性狀描述見表1。
二、鑒別
(一)化學法
1.羥肟酸鐵反應頭孢菌素在堿性條件下與羥胺作用,β-內酰胺環破裂生成羥肟酸;在稀酸中與高鐵離子反應呈色。《中國藥典》二部采用羥肟酸鐵反應鑒別頭孢哌酮,方法為:取本品約10mg,加水2ml與鹽酸羥胺溶液 取34.8%鹽酸羥胺溶液1份,醋酸鈉-氫氧化鈉溶液(取醋酸鈉10.3g與氫氧化鈉86.5g,加水溶解使成1000ml)1份,乙醇4份,混勻3ml,振搖溶解后,放置5分鐘,加酸性硫酸鐵銨試液1ml,搖勻,顯紅棕色。
2.鉀鹽或鈉鹽的鑒別反應 頭孢菌素類藥物中,許多制成鉀鹽或鈉鹽,因而顯鉀
鹽或鈉鹽的鑒別反應。
(二)光譜法
紅外吸收光譜法反映了分子的結構特征,該法具有專屬性高的特點,各國藥典對收載的頭孢菌素類抗生素均采用了本法鑒別。
(三)色譜法
高效液相色譜法和薄層色譜法被廣泛應用于本類藥物的鑒別。利用比較供試品與對照品主峰的保留時間(tR)或斑點的比移值(Rf)是否一致進行鑒別。《中國藥典》二部收載的頭孢菌素類抗生素大多采用高效液相色譜法進行鑒別。如頭孢呋辛鈉規定在含量測定項下記錄的色譜圖中,供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致。
藥典采用薄層色譜法鑒別頭孢克洛。方法為:取本品適量,加水溶解并制成每1ml中約含2mg的溶液,濾過,取續濾液作為供試品溶液;另取頭孢克洛對照品適量,加水制成每1ml中約含2mg的溶液,作為對照品溶液;再取對照品和供試品適量,加水制成每1ml中各含2mg的溶液,作為混合溶液。照薄層色譜法試驗,吸取上述3種溶液各2μl,分別點于同一硅膠H薄層板[取硅膠H2.5g,加0.1%羧甲基纖維素鈉溶液8ml,研磨均勻后鋪板(10cm×20cm),經105℃活化1小時,放入干燥器中備用],以新鮮配制的0.1mol/L枸櫞酸溶液-0.1mol/L.磷酸氫二鈉溶液-6.6%茚三酮的丙酮溶液(60:40:1.5)為展開劑,展開,晾干,于110℃加熱15分鐘后檢視。供試品溶液所顯主斑點的顏色和位置應與對照品溶液的主斑點相同,混合溶液應顯一個斑點。
三、檢查
頭孢菌素類抗生素生產工藝復雜,生產過程不易控制,異物污染可能性較大,因此化學純度較低。本類藥物結構、組成復雜,同系物多,異構體多。此外,β-內酰胺環穩定性差,容易導致產品發生降解。故本類藥物中易引入較多雜質,檢查項目主要有高分子聚合物、有關物質、異構體、細菌內毒素、熱原、無菌、溶出度、結晶性、溶液的澄清度與顏色、水分、酸度或酸堿度、熾灼殘渣、重金屬等,個別藥物還檢查沉降體積比、吸光度等。本品的含水量與pH對穩定性影響較大,故本品一般需控制水分、酸度或酸堿度。水分的測定數據直接影響本品的含量測定結果,一般采用費休法測定水分。
(一)特殊雜質檢查
1.高分子聚合物的檢查抗生素類藥物中的高分子雜質是指分子量大于藥物本
身的雜質總稱,其分子量一般在1000～5000,個別可至10000Da左右。高分子雜質主要分為蛋白(多肽)類雜質和聚合物雜質兩類,前者主要來自生產過程的殘留或污染,后者主要是抗生素在生產、貯存和使用條件下發生的分子間的聚合反應產物。抗生素所致的速發型過敏反應和其中的高分子雜質有關,因此檢查高分子聚合物是控制產品內在質量的重要環節。藥典采用分子排阻色譜法測定某些β-內酰胺類抗生素品種中高分子雜質的含量。
在特定條件下,β-內酰胺類抗生素可以締合成與高分子雜質有相似色譜行為的
締合物,即在Kav(有效分配系數)=0處表現為單一的色譜峰。以藥物自身為對照品,測定其在特定條件下締合時的峰響應指標;再改變色譜條件,測定供試品中高分子雜質和藥物分離后Kav=0處高分子雜質的峰響應指標;按外標法計算,即得藥品中的高分子雜質相當于藥品本身的相對含量。
例如,《中國藥典》二部規定頭孢呋辛鈉應檢查頭孢呋辛聚合物。檢查方法如下。
色譜條件與系統適用性試驗 用葡聚糖凝膠G-10(40～120μm)為填充劑;玻璃內徑1.0-1.4cm,主高度30-40cm;pH7.0的0.025mol/L磷酸鹽緩沖液為流動相A,以水為流動相B,流速約為每分鐘1.5ml,測波長為254nm。
對照品溶液的制備 取頭孢呋辛對照品約20mg,精密稱定,加水溶解并定量稀釋制成每1ml中約含40μg的溶液。
測定法 取本品約0.2g,精密稱定,置10ml量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,立即精密量取100～200μl注入液相色譜儀,以流動相A為流動相進行測定,記錄色譜圖。另精密量取對照品溶液100～200μl注入液相色譜儀,以流動相B為流動相,同測定。按外標法以峰面積計算,含頭孢呋辛聚合物以頭孢呋辛計,不得過0.2%。
2.有關物質和異構體的檢查本類藥物多采用半合成方法制備,在生產中容易引入原料、中間體、副產物等雜質,統稱為有關物質,并可能生成異構體。由于本類藥物廣泛應用HPLC法測定含量,因此,有關物質和異構體檢查也同時采用HPLC法。頭孢氨芐是以青霉素鉀為原料,經氧化、擴環、裂解得7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸,再與側鏈α-苯甘氨酸縮合而成。因此成品中可能引入7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸、α-苯甘氨酸和其他雜質。《中國藥典》二部采用HPLC法檢查頭孢氨芐中有關物質。方法為:精密稱取本品適量,加流動相A溶解并稀釋制成每1ml中約含1.0mg的溶液,作為供試品溶液;精密量取1ml,置100ml量瓶中,用流動相A稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液;取7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸對照品和α-苯甘氨酸對照品各約10mg精密稱定,置同一100ml量瓶中,加pH7.0磷酸鹽緩沖液約20ml,超聲使溶解,再用流動相A稀釋至刻度,搖勻。精密量取2.0ml,置20ml量瓶中,用流動相A稀釋至刻度,搖勻,作為雜質對照品溶液。
頭孢呋辛酯中容易引入異構體,藥典規定頭孢呋辛酯及其片劑、膠囊應檢查異構體。頭孢呋辛酯中異構體的檢查方法為:取本品適量,照含量測定項下的方法試驗,供試品溶液色譜圖中頭孢呋辛酯A異構體峰面積與頭孢呋辛酯A、B異構體峰面積和之比應為0.48～0.55。
(二)安全性檢查
主要檢查細菌內毒素和無菌,個別頭孢類藥物檢查熱原、異常毒性。
1.細菌內毒素 細菌內毒素是革蘭陰性細菌細胞壁外層中的脂多糖和蛋白的復合物。細菌內毒素是對人和實驗動物致熱性最強的一種生物活性物質,故細菌內毒素檢查是抗生素質量控制中的一項重要指標,關系用藥安全和患者的生命安危。
《中國藥典》二部利用試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素,以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定。藥典二部規定頭孢呋辛鈉應檢查細菌內毒素,方法為:取本品,依法檢查,每1mg頭孢呋辛中含內毒素的量應小于0.10EU。
2.無菌 無菌檢查法是指檢查藥典要求無菌的藥品、醫療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。用微生物發酵工藝提取的抗生素容易引入細菌,為保證用藥安全,藥典二部規定頭孢呋辛鈉應檢查無菌,方法為:取本品,用適宜溶劑溶解后轉移至不少于500ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中,用薄膜理后,依法檢查,應符合規定。若供試品符合無菌檢查法的規定,僅表明供試品在該檢查條件下未發生微生物污染。
3.熱原 熱原是指藥物中含有的能引起體溫升高的雜質,主要來源于革蘭陰性細
菌。用微生物發酵工藝提取的抗生素尤其容易污染熱原。含有熱原的注射劑,靜脈注入人體15分鐘左右,就能引起發冷、寒戰、熱,嚴重時出現惡心、嘔吐等,甚至昏迷、休克死亡。藥典二部采用家兔作為實驗動物模型,將一定劑量的供試品靜脈注入家兔體內,在規定的時間內,觀察家兔體溫升高的情況,以判斷供試品中所含熱原的限度是否符合規定。在頭孢類藥物中,基本由細菌內毒素檢查取代熱原檢查。
4.異常毒性 異常毒性檢查法是指給予小鼠一定劑量的供試品溶液,在規定時間
內觀察小鼠出現的死亡情況,以判定供試品是否符合規定的一種方法。如,藥典規定頭孢地嗪鈉應檢查異常毒性,方法為:取本品,加氯化鈉注射液制成每1ml中含0.1g的溶液,依法檢查,按靜脈注射法給藥,應符合規定。
四、含量測定
《中國藥典》二部中收載的本類藥物及其制劑共70種之多,均采用高效液相色譜法測定含量。高效液相色譜法能有效分離供試品中可能存在的降解產物、殘留的原料及中間體等雜質,并能準確定量。藥典采用該方法測定頭孢氨芐及其膠囊的含量、頭孢克洛及其制劑的含量,頭孢呋辛酯及其制劑的含量。
1.外標法測定頭孢氨芐的含量
2.外標法測定頭孢氨芐膠囊的含量取裝量差異項下的內容物,混合均勻,精密稱取適量(約相當于頭孢氨芐0.1g),置100ml量瓶中,加流動相適量,充分振搖,使頭他氨芐溶解,再加流動相稀釋至刻度,搖勻,濾過,精密量取續濾液10ml,置50ml量瓶中用流動相稀釋至刻度,搖勻,照頭孢氨芐項下的方法測定,即得。頭孢氨芐膠囊相當于標示量的百分含量按式計算:
式中,AR為對照品的峰面積;Ax為供試品的峰面積;Vs為供試品溶液的定容體積;VR為對照品溶液的定容體積;DS為供試品溶液的稀釋倍數;DR為對照品溶液的稀釋倍數;mR為對照品的稱樣量;ms為供試品的取樣量;
為平均裝量。