藥物檢測案例維生素類藥物及其制劑的質量檢測

一、性狀

維生素B₁、維生素C、維生素A和維生素E的性狀描述見表1。

二、鑒別

(一)化學法 

1.硫色素反應維生素B₁在堿性溶液中,可被鐵氰化鉀氧化生成硫色素,硫色素在正醇或異丁醇中顯藍色熒光。方法為:取本品約5mg,加氫氧化鈉試液2.5ml溶解后加鐵化鉀試液0.5ml與正醇5ml強力振搖2分鐘,置使分層,上面的醇層顯強的藍色熒光加酸使成酸性、熒光即消失再加堿使成堿性,熒光又顯出。

用此法別維生素B₁片時,需水溶解,過濾,取濾液鑒別;注射液的鑒別方法與原料藥相同。

2.沉淀反應   維生素B₁結構中的兩個雜環可與生物堿沉淀劑反應:與碘化永鉀生成淡黃色沉淀;與碘試液生成紅色沉淀;與硅鎢酸生成白色沉淀;與苦酮酸生成扇形白沉淀。

3.與硝酸反應   維生素B₁與NaOH,分解產生Na₂S,可與硝酸鉛反應生成黑色沉淀。

4.氧化反應

(1)與硝酸銀反應:維生素C中的烯二醇基性具有強還原性,與硝酸銀反應生成黑色

 金屬銀沉淀。

(2)與2.6-二氯靛酚反應:維生素C的烯二醇基具有強還原性,酸性條件下與玫瑰紅色的2.6-二氯靛酚反應,使其變成無色的酚亞胺。

方法為:取本品0.2g,加水10ml溶解后,分成二等份,在一份中加硝酸銀試液0.5ml,即生成銀的黑色沉淀。在另一份中加二氯靛酚鈉試液1-2滴,該試液的顏色即消失。

用此法鑒別維生素C片劑、泡騰顆粒時,需加水溶解,過濾,取濾液鑒別;泡騰片用無水乙醇溶解,過濾,取濾液鑒別;注射液的鑒別方法與原料藥相同。

(3)與其他氧化劑反應:維生素C還可與其他氧化劑反應(如亞甲藍、高錳酸鉀、堿性酒石酸銅和磷鉬酸等)生成去氫抗壞血酸,使氧化劑的顏色消失,或使溶液產生沉淀或呈現其他顏色。維生素E與硝酸反應,使溶液顯橙紅色,這是因為維生素E在酸性條件下水解生成生育酚,生育酚同時被硝酸氧化為鄰醌化合物生育紅而顯橙紅色。

5.糖類反應   維生素C可在三氯醋酸或鹽酸存在下水解、脫羧、生成戊糖、再轉化為糠醛,加入吡咯,加熱至50℃,顯藍色。

6.三氯化銻反應  維生素A在飽和無水三氯化銻的無醇三氯甲烷溶液中即顯藍色,漸變成紫紅色。其機制為維生素A和氯化銻(Ⅲ)中存在的親電試劑氯化高銻(V)作用形成不穩定的藍色碳正離子。

方法為:取維生素A油溶液1滴,加三氯甲烷10ml振搖使溶解,取2滴,加三氯甲烷2ml與25%三氯化銻的三氯甲烷溶液0.5ml,即顯藍色,漸變成紫色。

(二)光譜法

 1.紫外-可見分光光度法維生素C在0.01mol/L酸溶液中,于243nm波長處有最大吸收。

2.紅外分光光度法  原料藥維生素C可采用紅外分光光度法進行鑒別,要求供試品的紅外光吸收圖譜應與對照圖譜一致。

三、檢查

維生素C中存在微量的銅、鐵離子時,可加速其氧化變色。《中國藥典》2010年版二部規定原子吸收分光光度法檢查維生素C中鐵和銅的限量。

維生素C中鐵的檢查方法:取本品5.0g兩份、分別置25ml量瓶中,一份中加0.Imol/L硝酸溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(B),另一份中加標準鐵溶液(精密稱取硫酸鐵863mg,置1000ml量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,精密量取10ml,置100ml量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻)1.0ml,加0.1mol/L硝酸溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液(A)。照原子吸收分光光度法,在248.3nm的波長處分別測定,應符合規定。

維生素C中銅的檢查方法:取本品2.0g兩份,分別置25ml量瓶中,一份中加 0. 1mol/L硝酸溶液溶解而刻度,搖勻,作為供試品溶液(B);另一份中加標準銅液(精密稱取硫酸制393mg,置1000ml量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,據勻,精密量取10ml,置1000ml量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻)1.0ml,加0.1mol/L硝酸溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對管液(A)。照原子吸收分光光度法,在324.8nm的波長處分別測定,應符合規定。

四、含量測定

 維生素B₁及其制劑常用的含量測定方法有硅鎢酸重量法、硫色素熒光法、銀量法、酸性染料比色法、非水溶液滴定法及紫外一可見分光光度法等;維生素C及其制劑常用氧化還原法測定其含量。

(一)容量法

1.非水溶液滴定法維生素B₁有兩個堿性基團,可與高氯酸以1:2的比例反應。根據消耗高氯酸的量可計算維生素B₁的含量。測定時需加入醋酸汞消除鹽酸的干擾。

維生素B1的含量測定方法:取本品約0.12g,精密稱定,加冰醋酸20ml,微熱溶解后,放冷,加醋酐30ml,照電位滴定法,用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定,并將滴定的結果用空白試驗校正。每1ml高氯酸滴定液(0.1mol/L)相當于16.86mg的C₁₂H₁₇CIN₄OS·HCl。按干燥品計算,含C₁₂H₁₇CIN₄OS·HCl不得少于99.0%。

2.碘量法  維生素C結構中的二烯醇基具有還原性,可用氧化還原法測定其含量,如碘量法和2,6-二氯靛酚法等。《中國藥典》二部規定用碘量法測定維生素C及其制劑的含量。

維生素C的含量測定方法:取本品約0.2g,精密稱定,加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解,加淀粉指示液1ml,立即用碘滴定液(0.05mol/L)滴定,至溶液顯藍色并在30秒鐘內不褪色。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)當于8.806mg的CH06本品含C₆H₈O₆不得少于99.0%。

維生素C片的含量測定方法:取本品20片,精密稱定,研細,精密稱取適量(約相當于維生素C0.2g),置100ml量瓶中,加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml的混合液適量,振搖使維生素C溶解并稀釋至刻度,搖勻,迅速濾過,精密量取續濾液50ml,加淀粉指示液1ml,立即用碘滴定液(0.05mol/L)滴定,至溶液顯藍色并持續30秒不褪色。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相當于8.806mg的C₆H₈O₆。本品含維生素C(C₆H₈O₆)應為標示量的93.0%～97.0%。

維生素C注射液的含量測定方法:精密量取本品適量(約相當于維生素C0.2g)加水15ml與丙酮2ml,搖勻,放置5分鐘,加稀醋酸ml與淀粉指示液1ml,用碘滴定液0.05mol/L)滴定,至溶液顯藍色并在30秒鐘內不褪色。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相當于8.806mg的C₆H₈O₆。本品含維生素C(C₆H₈O₆)應為標示量的93.0%~97.0%。

(二)紫外-可見分光光度法

 維生素B₁分子中有共軛雙鍵,在紫外-可見區有吸收。pH=2時,維生素B1在246nm處有最大吸收,吸收系數為421。《中國藥典》2010年版采用紫外-可見分光光度法測定維生素B1片及注射液的含量。維生素A分子中有共多烯側鏈,在325～328nm的波長范圍內有最大吸收。

1.維生素B₁片的含量測定方法取本品20片,精密稱定,研細,精密稱取適量(約相當于維生素B₁25mg),置100ml量瓶中加鹽酸溶液(9→1000)約70ml,振搖15分鐘使維生素B₁溶解,用上述溶劑稀釋至刻度,搖勻,用干燥濾紙濾過,精密量取續濾液5ml,置另一100ml量瓶中,再加上述溶劑稀釋至刻度,搖勻,照紫外-可見分光光度法,在246nm的波長處測定吸光度,按C₁₂H₁₇ClN₄OS·HCl的吸收系數為421計算,即得。本品含維生素B₁(C₁₂H₁₇ClN₄OS·HCl)應為標示量的90.0%-110.0%。

2.維生素B注射液的含量測定方法精密量取本品適量(約相當維生素B₁50mg)置200m量瓶中,加水稀釋至刻度,勻,精密量取5ml,100ml量瓶中,加鹽酸溶液(9→1000)稀釋至刻度,照分光光度法,在246nm的波長處測定吸度,按C₁₂H₁₇ClN₄OS·HCl的吸收系數為421計算,即得。本品含維生素B₁(C₁₂H₁₇ClN₄OS·HCl)應為標示量的93.0%~107.0%。

3.維生素A的含量測定方法(第一法)取供試品適量,精密稱定,加環已烷溶解定量稀釋制成每1m中含9-15U的溶液,照紫外一見分光光度法,測定其收的波長,并在表中所列各波長處測定吸光度,計算各光度與波長328nm處吸光度的比值和波長328處的值。本品含維生素A應為標示量的70%～103.0%。

如果吸收峰波長為326～320mm,且所測得各波長吸光度比值不超過表中規定的±0.02,可用下式計算含量:

每1g供試品中含有的維生素A的單位=×1900

如果吸收峰波長為326～329nm,但所測得的各波長吸光度比值超過表中規定值的±0.02,應按下式求出校正后的吸光度,然后再計算含量:

如果在328nm處的校正吸光度與未校正吸光度相差不超過±3.0%,則不用校正吸光度,仍以未經校正的吸光度計算含量。

如果校正吸光度與未校正吸光度相差為-15%~-3%則以校正吸光度計算含量如果校正吸光度超出未校正吸光度的-15%~-3%或者吸收峰波長不326~329nm,則供試品須按“皂化法”測定。

(三)色譜法

維生素B₆又名鹽酸吡哆醇,藥典二部規定用高效液相色譜法測定維生素B₆及其制劑的含量。維生素E含量測定方法很多,目前,各國藥典多采用氣相色譜法,該法簡便、快速、專屬性。藥典收載的維生素E及其制劑均采用氣相色譜法測定含量。

1.維生素B₆的含量測定方法照高效液相色譜法測定。

色譜條件與系統適用性試驗:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,以0.04%戊烷磺酸鈉溶液(用冰醋酸調節pH至3.0)-甲醇(85:15)為流動相,檢測波長為291nm。理論板數按維生素B₆峰計算不低于4000。

測定法取本品,精密稱定,加流動相溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.1mg的溶液,精密量取10μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,另取維生素B₆對照品,同法測定。

按外標法以峰面積計算,即得,按干燥品計算,含C₈H₁₁NO₃·HCl應為98.0%~102.0%。維生素B₆的含量按式計算。

A_s為供試品的峰面積;A_r為對照品的峰面積;D_s為供試品溶液的稀釋倍數;D_r為對照品溶液的稀釋倍數;m_s為供試品的稱樣量;m_r為對照品的稱樣量;V_r為

 對照品溶液的定容體積;V_s為供試品溶液的定容體積。

2.維生素E的含量測定方法   由于氣相色法操作簡便、快速、專展性強,所以

 目前藥典收載的維生素E及其制劑均采用氣相色譜法測定含量。

色譜條件與系統活用性試驗:用硅酮(OV-17)為固定相,涂布濃度為2%的填充柱,或用100%二甲基聚硅氧烷為固定相的毛細管柱,柱溫為265℃。理論板數按維生素E峰計算不低于500(填充柱)或5000(毛細管柱),維生素E峰與內標物質峰的分離度應符合要求。

校正因子的測定:取正三十二烷適量,加正己烷溶解并稀釋成每1ml中含10mg的溶液,作為內標溶液。另取維生素E對照品的20mg,精密稱定,置棕色具塞瓶中,特密加內標溶液10ml,密塞,振搖使溶解,取1-3μl注入氣相色譜諧儀,按式計算校正因子。

式中,A_S為內標物質的峰面積;A_r為對照品的峰面積;C_s為內標溶液的濃度;Cr對照品溶液的濃度。

測定法:取本品約20mg,精密稱定,置棕色具塞瓶中,精密加內標溶液10ml,密塞,振搖使溶解,取1-3μl注入氣相色譜儀,測定,計算,即得。本品含 C₃₁H₅₂O₃應為 96.0%～102.0%。