一、性狀
吡哌酸、諾氟沙星、鹽酸環丙沙星和氧氟沙星的性狀描述見表1。
二、鑒別
(一)化學法
1.丙二酸反應 此反應對叔胺基團有選擇性。本類藥物分子中含有叔胺基團,與丙二酸在醋酐中共熱時,呈現棕色、紅色紫色或藍色。藥典采用該法鑒別諾氟沙星軟膏、乳膏。
諾氟沙星軟膏的鑒別方法:取含量測定項下的供試品溶液5ml,置水浴上蒸干,殘渣中加丙二酸約50mg與醋酐1ml,在水浴中加熱10分鐘,溶液顯紅棕色。
2.氯化物鑒別反應 本類藥物的鹽酸鹽,可利用氯化物鑒別反應進行鑒別,如鹽酸環丙沙星采用該法鑒別。
(二)光譜法
1.紫外-可見分光光度法 本類藥物結構中具有苯環或芳雜環共軛結構,在紫外光區有特征吸收,可用于定性鑒別。藥典采用此法鑒別吡哌酸(原料、片劑、膠囊劑)氧氟沙星(片、膠囊、眼膏、滴眼液、滴耳液)諾氟沙星(乳膏、滴眼液)等。例如,氧氟沙星膠囊的鑒別方法為:取本品內容物適量,用0.1mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中約含氧氟沙星6μg的溶液,濾過,取續濾液,照紫外-可見分光光度法測定,在294nm的波長處有最大吸收。
2.紅外分光光度法藥典對收載的喹諾酮類原料藥幾乎均采用了本法進行鑒別。如司帕沙星的鑒別:本品的紅外光吸收圖譜應與對照的圖譜一致。
(三)色譜法
1.薄層色譜法藥典采用薄層色譜法鑒別諾氟沙星、氧氟沙星、鹽酸環丙沙星(原料、片、膠囊)等。
例如,諾氟沙星的鑒別方法為:取本品與諾氟沙星對照品適量分別加三氯甲烷一甲醇(1:1)制成每1ml中含2.5mg的溶液,作為供試品溶液與對照品溶液。照薄層色法試驗,吸取上述兩種溶液各10μl,分別點于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷醇-濃氨溶液(15:10:3)為展開劑,展開,晾干置紫外線燈(365nm)下檢視。供試品溶液所顯主斑點的位置與熒光應與對照品溶液主斑點的位置與熒光相同。
2.高效液相色譜法藥典收載的喹諾酮類藥物的原料藥及其絕大多數制劑采用的記錄的色譜圖中,HPLC法鑒別。例如,鹽酸環丙沙星的鑒別方法:在含量測定項下的記錄的色譜圖中,供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致。
三、檢查
喹諾酮類藥物的檢查項目有溶液的澄清度、有關物質、顏色、吸光度、干燥失重灼殘渣、重金屬、細菌內毒素等。此處重點介紹溶液的澄清度、干燥失重、有關物質及溶出度測定法。
(一)一般雜質檢查
1.溶液的澄清度本類藥物在堿溶液中易溶,采用氫氧化鈉試液為溶劑,檢查堿中不溶性雜質,主要為哌嗪等堿性化合物及中間體等。例如,藥典規定諾氟沙星溶液的澄清度檢查方法為:取本品5份,各0.5g,分別加氫氧化鈉試液10ml溶解后,溶液應澄清;如顯渾濁,與2號濁度標準液比較,均不得更濃注意:進行本項檢查時要迅速觀察因為時間稍長,有些堿中不溶性雜質可分解而溶解。
若被測藥物為鹽,一般以水為溶劑,檢查水中不溶性雜質。例如,鹽酸環丙沙星“溶液的澄清度與顏色”檢查方法為:取本品0.1g,加水10ml溶解后,溶液應澄清;如顯色,與黃色或黃綠色4號標準比色液比較,不得更深。
2.干燥失重 喹諾酮類藥物在潮濕空氣中易吸收水分,故本類藥物一般規定檢查干燥失重。例如,吡哌酸檢查干燥失重的規定限度為150%～16.0%,若小于15.0%,說明其中混有無水物。吡哌酸含3分子結晶水,理論含水量為15.12%。藥動學試驗表明,口服給藥后三水合物的血藥濃度比無水物高。尿中排泄也明顯優于無水物。三水合物較無水物在水中和消化道中的溶解速度快,生物利用度高對銅綠假單胞菌感染的療效也比無水物高,但兩者在毒性上并無差別。可見吡哌酸的干燥失重檢查是控制質量的重要項目。
(二)特殊雜質檢查
喹諾酮類藥物在生產和貯藏中可能引入原料、中間體、副產物、異構體、分解產物等有關物質,影響藥物療效和產生毒副反應,應進行嚴格控制。藥典主要采用HPLC法檢查喹諾酮類藥物的有關物質,如諾氟沙星氧氟沙星、左氧氟沙星及鹽酸環丙沙星等有關物質的檢查,采用C18柱,流動相梯度洗脫,紫外檢測的方法。
(三)制劑檢查
本類藥物在水中極微溶解,體內吸收受到其溶解速度的影響,因而需要測定其口服固體制劑的溶出度。藥典采用紫外分光光度法測定吡哌酸,鹽酸環丙沙星,氧氟沙星的片、膠囊及諾氟沙星膠囊的溶出度。
諾氟沙星膠囊溶出度的測定方法:取本品照溶出度測定法(第二法)以醋酸緩沖液(取冰醋酸2.86ml與50%氫氧化鈉溶液ml,加水900ml,振搖,用冰醋酸或50%氫氧化鈉溶液調節pH至4.0,加水至100ml)1000ml為溶出介質,轉速為每分鐘50轉,依法操作,經30分鐘時,取溶液適量,濾過,精密量取續濾液適量,用溶出介質定量稀釋制成每1ml約含5μg的溶液,作為供試品溶液,照紫外-可見分光光度法,在277nm的波長處測定吸光度;另取諾氟沙星對照品適量,密稱定,加溶出介質溶解并定量稀釋制成每1ml中含5μg的溶液,同法測定,計算每粒的溶出量。限度為標示量75%,應符合規定。
四、含量測定
藥典主要采用高效液相色譜法測定喹諾酮類藥物的含量,少數幾個品種的含量測定采用非水滴定法和紫外-可見分光光度法。
(一)非水溶液滴定法
本類藥物分子結構中具有哌嗪基團,堿性,可用酸性非水溶劑溶解樣品,以增加其堿性,以適當的指示劑或電位法指示終點,高氯酸為滴定液進行滴定。藥典采用該法測定吡哌酸的含量。
吡哌酸的含量測定方法:取本品約0.2g,精密稱定,加冰醋酸20ml溶解后,加結晶紫指示液1滴,用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液顯純藍色,并將滴定的結果用空白試驗校正。每1ml高氯酸滴定液(0.1mol/L)相當于30.33mg的C14H17FN5O3。
(二)紫外可見分光光度法
本類藥物分子結構中具有苯環或雜環共軛結構,在紫外光區有特征吸收,可用于定量。本法用于制劑的測定時,注意消除輔料的干擾。藥典采用該法測定吡哌酸片劑、膠囊及諾氟沙星乳膏的含量。
吡哌酸片的測定方法:取本品10片,精密稱定,研細,精密稱取適量(約相當于C14H17N5O3·3H2O 0.2g),置500ml量瓶中,0.01%鹽酸溶液適量,超聲使吡哌酸溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過,精密量取續濾液2m,置250ml量瓶中,加0.01%鹽酸液稀釋至刻度,搖勻,照紫外可見分光光度法在275nm的波長處測定吸光度;精密稱取吡哌酸對照品適量,加0.01%鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成每1ml中約含C14H17N5O3·3H2O 3μg的溶液,同法測定。計算出供試品中C14H17N5O3·3H2O的含量。
(三)高效液相色譜法
喹諾酮類藥物含有酸性羧基和堿性哌嗪基,能在水中解離,多用離子抑制色譜法進行含量測定。通過向流動相中加入少量弱酸、弱堿或緩沖鹽為抑制劑,調節流動相的pH或利用同離子效應,抑制相應的弱酸、弱堿解離使被測組分保持分子狀態,以增加它們在反相固定相中的溶解度,延長保留時間,以達到分離有機弱酸、弱堿的目的。采用離子抑制色譜法測定時,流動相的pH需為2～7.5。試驗完成后,應及時用不含酸、堿及緩沖鹽的流動相沖洗管路,以防腐蝕儀器流路系統。藥典采用離子抑制色譜法測定鹽酸環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星及其制劑等藥物的含量。