進樣器
早期使用隔膜和停流進們器,裝在色譜柱入口處。現在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求:密封性好,死體積小,重復性好,保證中心進樣,進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為:隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。
1)隔膜進樣
用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內,可把樣品直接送到柱頭填充床的中心,死體積幾乎等于零,可以獲得最佳的柱效,且價格便宜,操作方便。但不能在高壓下使用(如10MPA以上);此外隔膜容易吸附樣品產生記憶效應,使進樣重復性只能達到1～2%;加之能碉各種溶劑的橡皮不易找到,常規分析使用受到限制。
2)停流進樣
可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染,停泵或重新啟動時往往會出現“鬼峰”;另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中,效果較好。
3)閥進樣
一般HPLC分析常用六通進樣閥(以美國RHEODYNE公司的7725和7725I型最常見),其關鍵部件由圓形密封墊子(轉子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積在存在,柱效率低于隔膜進樣(約下降5～10%左右),但耐高壓(35～40MPA),進樣量準確,重復性好(0.5%),操作方便。
六通閥進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。
①用部分裝液法進樣時,進樣量應不大于定量環體積的50%(最多75%),并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注器取樣的熟練程度,而且易產生由進樣引起的峰展寬。
②用完全裝液法進樣時,進樣量應不小于定量環體積的 5～10倍9最少3倍),這樣才能完全置換定量環內和流動相,消除管壁效應,確保進樣的準確度及重復性。
六通閥使用和維護注意事項:
①樣品溶液進樣前必須用0.45UM濾膜過濾,以減少微粒對進樣閥的磨損。
②轉動閥芯時不能太慢,更不能停留在中間位置,否則流動相受阻,使泵內壓力劇增,甚至超過泵的最大壓力;轉到進樣位時,過高的壓力將使柱頭損壞。
③為防止緩沖鹽和樣呂殘留在進樣閥中,每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用水沖洗,或先用能溶解樣品的溶劑沖洗,再用水沖洗。
4)自動進樣
用于大量樣品的常規分析。
自動進樣時,連接轉子的手柄或把手被電動馬達所代替,實現進樣閥相位的改變。自動進樣一般有三種模式,分別為吸入式自動進樣,推入式自動進樣以及一體式自動進樣。不同的自動進樣方式具有不同的有點,同時也各自具有不同的缺點。
4.1 吸入式自動進樣
吸入式自動進樣,亦即通過抽拉注射器將樣品溶液吸入到定量環中,首先是進樣閥處于injection相位(圖7A),流動相從混合之后通過定量環進入色譜柱。進樣程序開始時,進樣閥相位調整到loading位(圖7B),樣品在負壓的作用下進入定量環,之后進樣閥重新調整injection相位,樣品溶液隨流動相進入色譜柱。
吸入式自動進樣器,由于機械結構簡單,因而易于維護以及便于排除故障,但較浪費樣品。
4.2 推入式自動進樣
推入式自動進樣,進樣閥處于injection相位的時候,流動相、定量環以及色譜柱構成一個完整的通路,此時進樣針座與廢液聯通。樣品經計量泵拉入臨時定量環中,之后進樣閥切換到loading相位,進樣針與針座連接,而針座與定量環連接,通過計量泵將樣品溶液推入到定量環中,之后進樣閥再次切換到injection相位,流動相、定量環以及色譜柱構成一個完整的通路,樣品溶液隨流動相進入色譜柱中。臨時定量環中的樣品溶液被排放入廢液在injection相位下,計量泵泵入洗針液,之后進樣閥切換到loading相位,進樣針座與定量環聯通,對定量環以及進樣針進行清洗,并經廢液排出。
推入式自動進樣器具有進樣體積靈活可調節的特點,相比吸入式自動進樣器,樣品消耗較小;同時樣品經進樣針座進入定量環的過程為低壓過程,便于控制以及對相關部位進行密封。由于其機械結構相比吸入式自動進樣器復雜,發生故障時,不易于排除。
4.3 一體式自動進樣
一體式自動進樣器的不同點在于進樣針與定量環是一個整體。如同推入式自動進樣器一樣,首先進樣閥處于injection相位,流動相經泵后與定量環及進樣針、進樣針座以及色譜柱形成通路,之后進樣閥切換到loading相位,樣品溶液隨著柱塞桿的拉出而進入到定量環中,此時流動相經泵之后直接與色譜柱相連。
進樣時,進樣閥重新切換回injection相位,樣品進入色譜柱。之后,在下次進樣之前一直處于該相位,以流動相對定量環以及取樣針進行沖洗。
該種進樣方式具有很少浪費樣品,甚至不浪費樣品的特點,特別適合于樣品量比較少的情況;同時由于方法運行的絕大部分時間,進樣閥均處于injection相位對定量環及進樣針進行沖洗,樣品殘留的可能性大大降低。由于進樣針座處于HPLC系統的高壓處,對于連接處的密封性要求高,且該種方式的最大進樣量也受到定量環大小的限制。
