實驗室分析方法液相色譜的定量方法—定量方法

峰高和峰面積測量僅是對檢測信號的一種響應該響應需同組分的濃度或者質量結合方可完成定量方法。無論在相同的還是不同的色譜條件下進行的試驗,均要采取一定的手段加以校正,才可能得到準確的定量結果。主成分自身對照法、峰面積歸化、內標法、外標法及標準加入法是HPLC定量分析中常用的校正技術。

不加校正因子的主成分自身對照法是最簡單的定量方法,也可以認為是峰面積歸一化法的特殊形式,其使用前提是假定雜質與主成分的響應因子基本相同一般情況下,如雜質與主成分的分子結構相似,響應因子將不會有太大差別。峰面積歸一化法簡便快捷,但因各雜質與主成分響應因子不一定相同、雜質量與主成分量不一定在同一線性范圍內、儀器對微量雜質和常量主成分的積分精度及準確度不相同等因素,所以在質量標準中采用有一定的局限性。

已知雜質對主成分的相對響應因子在0.9～1.1范圍內時,可以用主成分的自身對照法計算含量。超出0.9～1.1范圍時,宜用雜質對照品法計算含量,也可用加校正因子的主成分自身對照法。理想的定量方法為已知雜質對照品法與未知雜質不加校正因子的主成分自身對照法兩者的結合。研究人員可根據實際情況選用合適的定量方法。

1.歸一化法

對色譜圖中所有色譜峰進行積分后得出總的峰面積,每個峰在總面積中所占的百分數可視為歸一化峰面積。這種方法經常被用作確定雜質或次要組成在純物質中的含量。

把所有出峰的組分(混合物中各組分)含量之和按100%計,計算其中某一組分含量百分數的定量方法,稱為歸一化法。此方法要求欲測樣品中各組分均能流出色譜柱,并在檢測器上都能獨立產生信號,其中組分i的質量分數可按式(1)計算:

(1)

式中,A_i為組分i的峰面積;f_i為組分i的質量校正因子。當f_i為摩爾校正因子或體積校正因子時,所得結果分別為組分i的摩爾百分含量或體積百分數。

若樣品中的組分為同系物或同分異構體,校正因子近似相等,可不用引入校正因子,將峰面積或峰高直接利用歸一化公式計算:

(2)

高效液相色譜中通常使用的檢測器均為紫外熒光檢測器等選擇性檢測器,它們對不同結構化合物的響應值差別較大,有時甚至可以相差幾個數量級,對成分復雜的樣品分析而言,采用歸一化法定量顯然不可行。示差折光或蒸發光散射(ELS)檢測器等通用型檢測器對許多化合物有相似的響應,因此可以采用峰面積歸一化法定量。只含有UV響應相似化合物的樣品也可以采用這種方法定量。實際上,在無法得到標準品的情況下,采用歸一化峰面積方法進行定量分析相當方便,盡管可能不很準確。

歸一化法的優點是簡便、準確,進樣量、流速、柱溫等條件的變化對定量結果的影響很小。歸一化法也存在諸多缺陷,首先校正因子的測定較為麻煩,雖然一些校正因子可以從文獻中查到或經過理論計算求得,但要得到準確的校正因子,還需要用每一組分的基準物質直接測定;再者必須所有組分都出峰,且重疊色譜峰影響峰面積的測量。因此方法的應用受到一定程度的限制,在使用選擇性檢測器時,一般不用該法。

2.外標校正法

外標法是以被測組分的純晶(或已知其含量的標樣)作為標準品進行對比定量的一種方法。取一定量標準品(即一定量已知濃度的溶液)在給定的色譜條件下注入色譜柱,并由測器測定其響應值(峰面積或峰高)。在一定濃度范圍內,標樣量與響應值之間一般有比較好的正比例關系:

(3)

式中,A₀為峰面積;V₀為注入的標樣溶液體積;C₀為標樣溶液濃度;系數f₀可由實驗測得。 

在完全相同的色譜條件下,如果未知樣品的進樣量為V₁,實驗測得的與標樣相同組分的峰面積為A₁,根據式(3),由已知的A₀、V₀和c₀等即能求出樣品中該種組分的相對濃度c₁: 

(4)

對一種新樣品的高效液相色譜方法發展,或者儀器系統較為穩定的常規分析,一般需要采用外標作出校正曲線,并進一步進行定量校正。標準曲線法首先采用欲測組分的標準樣品繪制標準工作曲線,如圖1所示。

圖1 外標法校正曲線

用標準樣品配制成不同濃度的標準系列,在與分析欲測組分相同的色譜條件下,進行等體積進樣,作出峰面積對濃度的工作曲線。理論上,此標準工作曲線應是通過原點的直線。若測定法方法存在系統誤差,標準工作曲線不通過原點。標準工作曲線的斜率即為絕對校正因子。在圖1中,樣品1和樣品2對應的濃度分別為1.5mg/ml和24mg/ml。從理論上講,截距為零的校正曲線只需一個標樣即可確定,但在實際工作中一般使用兩個或更多個濃度的標準溶液。標準溶液的濃度應當與未知樣濃度接近色譜法在線性范圍內一般均能提供較好的響應與濃度的線性關系。對濃度較大的樣品,作適當稀釋,使之范圍落入線性范圍是一種很好的選擇。

在測定樣品中的組分含量時,應該在與繪制標準工作曲線完全相同的色譜條件下,注射相同量或已知量的試樣進行色譜分析,得到色譜圖,測量色譜峰的峰面積或峰高,根據校正曲線或響應因子,結合式(3)和式(4)可以求出其濃度值。 

標準曲線法的優點是:繪制好標準工作曲線后測定工作操作簡單,計算方便,可直接從第標準工作曲線上讀出含量,特別適合于大批量樣品分析。

標準曲線法的缺點是:儀器和操作條件對分析結果的影響很大,要求分析組分與其他組篇分完全分離、色譜分析條件也必須嚴格一致;而且標準物的色譜純度要求高(或用準確知道濃度的標準物,配置濃度時進行折算);標準曲線法屬于絕對定量法,標準工作曲線繪制時,一般使用欲測組分的標準樣品(或已知準確含量的樣品),因此對樣品前處理過程中欲測組分的變化無法進行補償。因為在樣品分析過程中,色譜條件(檢測器的響應性能、柱溫度、流動相流速及組成、進樣量、柱效等)很難嚴格保證完全相同,因此容易出現較大誤差,故標準工作曲線使用一段時間后應當采用標準物質及時進行校正。

對不需要大量制備的樣品而言,外標法非常有效外標法由于方法操作和計算都比較簡單,因此在液相色譜定量分析中經常被采用。但是這種方法對操作條件的穩定性要求較高,如檢測器靈敏度、流動相流速組成等不能有太大變化。為了使溶液濃度保持恒定,要求標樣及被測溶液被很好地密封,并且每次進樣體積要有好的重復性,否則將會影響到定量結果的準確性。液相色譜自動進樣器的進樣精度一般優于0.5%,這對大多數分析來說已足夠。如采用手工(注射器)操作,精密度要相對差一些,常需要配合其他校正技術。

外標法是實驗室最常用的定量方法,定量結果準確,它具有如下特點:不需所有的峰都流出或被檢測到,只對目標組分作校正;需要標準樣品;進樣量必須準確;儀器必須有良好的穩定性。

當被測試樣中各組分濃度變化范圍不大時,可不必繪制多點的標準曲線,而用單點校正法(比較法)。即配制一個和被測組分含量接近的標準溶液,定量進樣,根據被測組分和外標組分峰面積比或峰高比計算被測組分的含量。使用單點校正法需注意的是:當方法存在較大的系統誤差時,該法的誤差較大。

3.內標校正法

向樣品和校正溶液中加內標物是另一種校正技術。內標是不同于待測組分但能與待測組分完全分離的純物質,選擇的內標物還應當具有與待測組分相似的性質。當樣品中有幾種被測組分時,要求內標物的保留值介于幾種組分之間,還需避免與其他組分峰重疊。

適宜的內標物需滿足以下要求:化學結構與待測組分相似(同系物、異構體);不存在于待測樣品中:不與樣品組分發生任何化學反應;保留值與待測組分相近;濃度(響應值)與待測組分相當;與其他組分分離良好,但不能相距太遠;理化性質與待測組分相似,有相似分離萃取性質。內標法定量的具體操作步驟如下。

①先用分析天平準確稱取被測組分a的標樣W_a(g),再稱取內標物W_s(g),并加入一定量的溶劑將其溶解,如此得到的溶液作為混合標樣使用。取一定體積混合標樣注入色譜柱,得到的被測組分及內標物色譜峰的峰面積分別為A_a和A_s,相對響應值為:

(5)

值得注意的是,式(5)中W_a、W_s分別是混合標樣溶液中所含有的總的被測組分a及內標物的絕對質量。內標法校正曲線如圖2所示。

圖2 內標法校正曲線

 ②稱取含a組分的被測物W(g),另準確稱取內標物Ws’(g),將兩者混合并用一定量溶劑配制成混合溶液。取一定體積混合樣品注入色譜柱,可得被測組分及內標物的色譜峰面積分別為為Aa’和As’,則被測樣品中目標組分的響應值:

(6)

(7)

組分a在被測樣品中的含量:

(8)

如果被測樣品中除a組分外,還有b、c、d等其他組分,均可按此方法,先分別求得每種組分的響應值,然后再進一步求得組分在樣品中的含量。與外標校正類似,采用單點校正偏差較大,通常需要在不同濃度的樣品溶液中加入相同濃度的內標物配制成校正液,然后做出校正曲線。并進一步確定樣品中的目標組分含量。

內標法能夠補償由于儀器波動造成的樣品體積或濃度的改變。使用內標的一個很重要的原因在于樣品有時需要繁雜的預處理或制備樣品處理包括反應(衍生)、過濾、萃取等,這些步驟均會導致樣品的損失,而在樣品處理前加入合理選擇的內標物能夠校正這些損失。此外,內標法定量操作過程中將樣品和內標物混在一起注入色譜柱,進樣體積的不重復對峰面積所造成的影響可以在計算過程中被抵消,因此只要混合溶液中被測組分與內標物量的比值恒定,溶劑體積的變化就不會影響定量結果。

要求內標物與樣品中所有組分均完全分離或許比較苛刻,對簡單的混合物可能并不太難,但對復雜樣品來說很難達到,此時使用內標物也許并不實際。內標法的精密度次于外標法,因為內標要求對兩個峰的結果同時加以測定,而外標僅需一個峰。此外,選擇一種與其他峰無任何干擾的內標物也增加了方法的復雜性,因此內標法僅用在要求制備大量樣品方面,大多數常規分析采用外標法或許更適宜。

內標法的優點:使用時沒有歸一化法的那些限制可以抵消色譜條件(如柱溫、載氣流速、橋電流和進樣量)、進樣量不夠準確等原因帶來的定量分析誤差,特別是在樣品前處理(如濃縮、萃取、衍生化等)前加入內標物,然后再進行前處理時,可部分補償欲測組分在樣品前處理時的損失。內標法是以待測組分和內標物的峰高比或峰面積比求算試樣含量的方法。內標法可以分為校正曲線法、內標一點法(內標對比法)、內標二點法及校正因子法。

內標法的缺點:選擇合適的內標物比較困難,內標物的稱量要準確,操作復雜,且必須事先測得相對校正因子;同時加入內標物之后在分離條件上比原樣品要求更高一些(要求被測組分、內標物與其他組分都能分離)。

4.標準加入法

標準加入法也叫疊加比較法,是一種特殊的內標法。在選擇不到合適的內標物時,以樣品中已有組分作內標物,將該組分純物質加入到待測樣品中,然后在相同的色譜條件下,比較加入欲測組分純物質前后欲測組分的峰面積(或峰高),從而計算出欲測組分在樣品中的含量。 

圖3 標準加入法定量

(a)未知樣品的色譜分離譜圖;(b)加入內標物后的色譜分離譜圖(此圖以組分2為內標物)

標準加入法測定多組分樣品時,可選擇樣品中任一組分的純物質作為內標物(選擇樣品中含量小的組分)進行定量分析。具體步驟是:首先將樣品進行色譜分析,得到色譜圖,然后同內標法,稱取樣品m(g),加入作為內標物的組分m_i(g),在相同的色譜操作條件下進行試驗,得到對應的色譜圖。由圖3中的兩張色譜圖可知原樣品中組分i(組分2)的色譜峰面積分別為A₂,原樣品中加入標準物后的色譜峰面積分別為A'₂,然后按內標法計算出組分i(組分2)的定量結果。根據圖3(a),有:

(9) 

同樣,由圖3(b),有:

(10)

結合式(9)和式(10),得到組分i的計算公式

(11)

式中,wi為樣品中組分i的含量,

標準加入法的特點:進樣量不必十分精確,操作簡便,不需另外的標準物質作內標物,且更利于色譜分離;在樣品前處理前加入已知量的內標物組分,可避免在前處理過程中欲測組分的損失對定量結果的影響。為保護結果的準確性,要求兩次進樣量必須完全相同,并要求兩次色譜條件完全相同以保證校正因子完全相等。

5.痕量組分定量分析方法

HPLC是分析各種類型樣品中痕量組分(≤0.01%)的一種有效技術。HPLC分析痕量組分的優勢有:高分離能力,適合準確定量;較好的靈敏度和選擇性;某些樣品的預處理簡單;可以對原始樣品預富集以提高靈敏度。痕量分析的目的不同于混合物中主成分的定量檢測,需要解決的問題是測定混合物中一種或幾種組分的微量濃度。痕量分析的主要目的在于準確求出痕量組分的濃度,由于本身低濃度的限制,通常只要求精密度在5%～15%范圍內。

通常情況下,樣品無需預處理可以直接注入HPC柱中,然而有時痕量組分在分析之前必須經過固相萃取、液液萃取、過濾、組合柱和柱后反沖等處理步驟,以使其濃度達到可以檢測的范圍,或去除一些可能影響分離、檢測的組分。樣品中經常含有中性、堿性和酸性組分,以及疏水性較強的物質,樣品預處理能有選擇性地去除某些組分而保留所需組分此外樣品的預處理也可用來改善分析的準確度。

為最大限度地消除干擾并得到最佳的準確度痕量組分峰必須與鄰近峰完全分開。兩峰靠得很近且痕量組分峰較主成分先流出時,測量結果較精確。相反地,痕量組分峰在主成分峰拖尾的邊緣上洗脫時,精確定量將很困難。

痕量分析通常采用等度洗脫的分離模式,這樣可以得到較好的檢測基線和保留時間重現性。痕量組分的定量分析常采用峰高定量法。這種方法受峰重疊影響較小(準確度最好)且具有足夠的精密度。在痕量分析中為得到最好的靈敏度,一般盡可能加大進樣量。假若樣品量有限,使用較小內徑的色譜柱可以有效提高檢測靈敏度。

痕量分析外標校正法:大多數痕量組分的校正均是在樣品基體(如血清)中進行的。在空白(無分析物的基體)溶液中加入校正標準物,并進行正常的樣品制備。校正范圍應該包含樣品中待測物的濃度,且不應與樣品中待測痕量組分濃度相差太多。在精心設計的痕量分析方法中,校正曲線應該能外延至縱坐標的零點。如果外延至零點以下,說明在分離中已有部分樣品損失。如果校正線外延至零點以上,說明基線干擾或樣品中的其他組分產生干擾。

在痕量分析中一般需要樣品的預處理過程(萃取、固相萃取等),為確保足夠的準確度,對大多數系統分析物的絕對回收率至少為75%。當回收率太低或不穩定時,適當的內標能改善痕量分析的精度。假若空白樣品無法得到也可采用標準加入法。

標準加入法通過往樣品基體中加入不同質量的待測物,并分別測出樣品的響應值,用響應值對加入的待測物濃度作圖,然后將直線外延至與橫坐標相交所對應的值即是樣品中待測物的濃度(圖4)。

圖4 標準加入法對廢水中痕量五氯苯(PCP)的定量分析